超高效液相色譜法同時測定柑橘中11種類黃酮物質

冉 玥，焦必寧,*，趙其陽，田 玲，蘇學素，曾朝波

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業(yè)部柑橘產品質量安全風險評估實驗室，西南大學柑橘研究所，重慶 400712；3.西南大學化學化工學院，重慶 400716)

柑橘有豐富的營養(yǎng)價值和獨特的感官品質，其果實及果汁是世界消費最多的水果產品之一。柑橘果實中含有大量的類黃酮、類胡蘿卜素、維生素、酚酸等多種生理活性物質，還含有幾乎只存在于柑橘屬中的多甲氧基黃酮如川皮苷、桔黃酮等[1]。研究表明類黃酮物質具有抗炎活性[2-3]、抗癌作用、抗動脈粥樣硬化、抗氧化功能[4]和抗菌[5]等多種生理作用，國內外已有不少相關文獻報道將其用于功能食品和功能飼料的生產研究中。此外，類黃酮種類和含量的差異可作為鑒別柑橘產品摻假[6]、品種及原產地識別的依據[6-7]。Sentandreu等[8]研究了利用類黃酮組成及其含量并結合多元統(tǒng)計判別分析方法可識別不同種類柑橘汁，結果顯示，黃芩素與川皮苷含量比例與多甲氧基黃酮總含量可作為區(qū)分不同品種柑橘汁的特征性成分，能夠顯著地將7種柑橘汁區(qū)分開來。

目前已有不少柑橘類黃酮檢測的方法報道，其中普通高效液相色譜法[9-13]為主流的分析方法，還存在分析耗時長、測定的類黃酮化合物種類較少、精確度不高等問題。而超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，基于小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測等技術，具有快速高效、高分離度等特點[14-15]，現(xiàn)已廣泛應用于食品、藥物中各類物質的分析檢測中。Spácil等[16]比較了高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)和UPLC同時分離9種類黃酮物質的效果，結果表明，UPLC所用時間短2.5倍，使用溶劑少5.5倍，而分離度卻高1.7倍。目前國內較少有超高效液相檢測柑橘中類黃酮的方法報道。本研究采用正交試驗優(yōu)化樣品前處理方法，確定最佳儀器分析條件，建立超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法同時測定柑橘中11種類黃酮物質的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘樣品均采自中國農業(yè)科學研究院柑桔研究所國家果樹種質重慶柑橘圃。

圣草枸櫞苷(純度97.4%)、柚皮素-7-β-蕓香糖苷(純度95.0%)、新橙皮苷(純度99.9%)、香風草甙(純度93.1%)、柚皮素(純度98.2%)、橘黃酮(純度97.1%)、橙皮素(純度94.6%)(標準品) 美國Chroma Dex公司；甜橙黃酮標準品(純度98.5%) 德國Phytolba公司；川皮苷標準品(純度96.4%) 美國Sigma公司；橙皮苷(純度93.7%)、柚皮苷(純度97.3%)(標準品) 瑞士Fluka公司；甲醇(色譜純) 德國CNW Technologies有限公司。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC色譜儀(配有PDA檢測器及Empour工作站) 美國Waters公司；3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；KQ5200DE超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；超純水器 美國Millpore公司；0.22μm有機相針式濾器 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的制備

準確稱取圣草枸櫞苷、柚皮素-7-β-蕓香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風草甙、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川皮苷和橘黃酮各5.00mg，分別用色譜純甲醇溶解并定容至10.00mL容量瓶中，配成500mg/L標準品的母液備用。

采用逐級稀釋法用色譜純甲醇溶液將標準品溶液配制成一系列質量濃度的混合標準品溶液。

1.3.2 樣品的制備

柑橘果皮樣品：鮮果皮磨細后備用。準確稱取制好樣品1.00g于50mL離心管中，加入甲醇溶液10.00mL，50℃條件下超聲處理30min，以10000r/min離心10min，收集上清液，殘渣均以10mL提取劑重復提取兩次，合并上清液定容至50mL，0.22μm微孔濾膜過濾后待測。

柑橘汁樣品：采用手動壓榨法制取新鮮柑橘果汁，用雙層紗布過濾后備用。準確吸取制好果汁樣品2.00mL置于50mL離心管中，加入10.00mL甲醇振蕩1min，以10000r/min離心10min，分離上清液，殘渣以10mL提取劑重復提取一次，合并上清液定容至25mL，過0.22μm微孔濾膜后待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：A C Q U I T Y U P L C B E H C18分析柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動相：甲醇和0.2%乙酸溶液，采用梯度洗脫；柱溫：35℃；流速：0.3mL/min；定量波長為283nm和330nm，波長掃描范圍200～400nm，進樣量為3.0μL。以保留時間結合光譜掃描圖定性，采用外標法定量。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

對11種類黃酮(8種黃烷酮和3種多甲氧基黃酮)標準物質進行掃描，屬黃烷酮類的圣草枸椽苷、柚皮素-7-β-蕓香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風草甙、柚皮素和橙皮素均在283nm附近有最大吸收峰，而屬于多甲氧基黃酮的橙黃酮在330nm附近有最大吸收峰，川皮苷和橘黃酮在270nm和330nm附近都有最大吸收峰，綜合考慮最終選取283nm和330nm分別作為黃烷酮和多甲氧基黃酮的定量檢測波長。

2.2 柱溫和流動相的選擇

表 1 流動相洗脫程序Table 1 Gradient elution program

隨著柱溫升高，色譜柱的柱效增加，分析時間縮短，但對目標物的分離度有一定影響。綜合考慮確定35℃作為色譜柱分析時的溫度。

實驗比較不同流動相溶液的分離效果，結果顯示采用乙腈-乙酸溶液作為流動相時，在橙黃酮、川皮苷和橘黃酮出峰處存在較強基線干擾，而使用甲醇-乙酸溶液作為流動相時可消除基線干擾，因此選擇甲醇-乙酸溶液作為色譜分析的流動相體系。對于11種類黃酮物質來說，其結構和性質相似，需采用梯度洗脫的方式進行分離，經優(yōu)化確定梯度洗脫條件如表1所示。在該條件下，11種類黃酮標樣和柑橘樣品色譜圖見圖1，根據相對保留時間并結合待測化合物的特征吸收波譜進行定性。由圖1可以看出，樣品中類黃酮化合物與其他雜質分離，各個物質的峰形良好，分離度高。因此本方法適合柑橘中類黃酮化合物的測定。

圖 1 11種類黃酮標準混合溶液和柑橘樣品的超高效液相色譜圖(283nm和330nm)Fig.1 UPLC chromatograms of eleven flavonoids and citrus sample at 283 nm and 330 nm

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 柑橘果皮樣品前處理條件優(yōu)化

以鮮果皮作為試材，參考文獻[17]方法，通過單因素和正交試驗優(yōu)化果皮前處理條件。

單因素試驗比較甲醇、70%甲醇溶液、DMF、DMSO、甲醇＋DMF(1＋1)和甲醇＋DMSO(1＋1)等提取劑的提取效果，結果表明甲醇提取效果最佳。樣品提取溫度、超聲時間和提取次數(shù)優(yōu)化結果見圖2，結果表明，樣品提取溫度50℃、超聲時間30min、提取3次時，類黃酮提取量達最高。

圖 2 提取溫度(A)、時間(B)和次數(shù)(C)對果皮中類黃酮提取量影響Fig.2 Effects of extraction temperature (A), time (B) and times (C) on the total contents of flavonoids in peel

采用正交試驗設計確定超聲時溫度、超聲時間和提取次數(shù)3個因素的最佳組合。分別選取其中的4個水平：30、40、50、60℃；10、20、30、40min；1、2、3、4次。選擇L16(45)正交表，將3個因素分別定為第1、2、3列，根據正交表安排進行試驗。正交試驗安排及結果見表2。由表2結果的直觀分析及表3中對試驗結果的方差分析可以看出3個因素中最佳水平分別為50℃、30min和3次。此外，由極差大小可判定出3個因素對提取出類黃酮總量的影響大小為提取次數(shù)＞提取溫度＞提取時間，且在置信概率為95%時，提取次數(shù)對類黃酮提取量有顯著性影響。另一方面結果中的兩空列的值可代表因素間的相互作用和實驗中誤差大小，兩列的極差值和偏差平方和的值都較小，表明因素間沒有相互作用以及誤差很小。

結合單因素和正交試驗結果，最終確定果皮中類黃酮的最佳提取條件為樣品經甲醇50℃超聲30min，重復提取3次。這與傳統(tǒng)的浸提[18]或索氏提取法[19]等相比大大縮短了分析時間。

表 2 類黃酮的最佳提取條件正交試驗設計及結果Table 2 Experiment design and results of orthogonal test for extraction of flavonoids

表 3 試驗結果方差分析表Table 3 Analysis of variance of the test results

2.3.2 柑橘果汁樣品前處理條件的優(yōu)化

參考果皮處理方法，使用甲醇作為提取劑，經多次實驗確定振蕩1min后以10000r/min的轉速離心10min為前處理方式。實驗比較提取次數(shù)對總類黃酮提取量的影響，結果見圖3。由圖3可看出，隨著提取次數(shù)的增加，類黃酮提取總量增加。但對結果進行分析后顯示，提取2、3次和4次的結果間并無顯著性差異。考慮實驗成本和環(huán)保方面，選擇提取2次作為果汁的提取方法。

圖 3 提取次數(shù)對果汁中類黃酮提取總量的影響Fig.3 Effect of extraction times on total contents of flavonoids in juice

2.4 線性關系和檢出限

在上述色譜分析條件下，測定一系列質量濃度的標準溶液。以測得的各個類黃酮物質積分峰面積為縱坐標，質量濃度(mg/L)為橫坐標繪制標準曲線。各類黃酮的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍和方法檢出限如表4所示，11種類黃酮的檢出限(RSN=3)為0.005～0.02mg/kg，在各個類黃酮物質相應的線性范圍內其質量濃度與積分峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)達到0.9993以上。

表 4 11種類黃酮的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限Table 4 Linear range, linear equation, correlation coefficient and the limits of detection (LODs) of the investigated flavonoids

2.5 精密度和重復性實驗

將同一標準溶液連續(xù)進樣6次，以11種類黃酮物質的積分峰面積為對象，計算其相對標準偏差，以考察色譜儀器的精密度。結果表明，各類黃酮的其相對標準偏差(RSD)介于0.9%～1.3%，充分說明儀器具有較高的精密度。在不同時間內以該方法重復測定同一實際樣品5次，上機進樣量3μL，通過計算RSD以考察方法的重復性，結果顯示各類黃酮的RSD值為2.3%～4.2%，表明該方法具有良好的重復性。

2.6 回收率實驗

表 5 果皮和果汁回收率實驗結果Table 5 The results of recovery test

分別對果皮和果汁樣品進行兩個水平的加標回收率實驗，每個實驗均6次重復。根據樣品中各類黃酮物質含量確定該種物質標準樣加入量，按上述前處理方法及分析方法進行實驗，驗證該方法的準確性。結果如表5所示，果皮中各類黃酮物質的平均回收率在94.6%～100.2%，相對標準偏差在1.1%～3.7%，果汁中各類黃酮平均回收率在94.5%～101.8%，相對標準偏差在0.9%～3.9%。結果表明上述實驗方法準確度較高，能應用于柑橘中類黃酮物質的檢測分析。

2.7 實際樣品的測定

采用上述方法對檸檬、臍橙、南豐蜜橘和砂糖橘4個樣品的果皮和果汁中類黃酮含量進行測定，結果如表6所示。不同品種柑橘含有類黃酮種類和含量差異較大。檸檬中含有較多的圣草枸櫞苷，臍橙中含有較多的柚皮素-7-β-蕓香糖苷與橙皮苷，而南豐蜜橘和砂糖橘果皮中均含有較多多甲氧基黃酮類。幾種柑橘中均未檢測出柚皮苷、柚皮素與新橙皮苷且果汁中類黃酮含量遠遠低于果皮中的含量。

表 6 4種柑橘樣品中類黃酮含量測定Table 6 The contents of flavonoids in four citrus

3 結 論

建立了快速有效的同時測定柑橘樣品中11種類黃酮物質方法，11min內上述物質得到完全分離。該方法具有良好的精密度和準確度，檢出限低，能滿足分析要求。11種類黃酮物質在線性范圍內，其質量濃度與積分峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性關系。分析時間僅為普通液相色譜法的1/4，有機溶劑消耗較少，既降低了成本又減少了環(huán)境污染?？勺鳛楦涕贅悠分蓄慄S酮常規(guī)檢測分析方法。

[1] LI Shiming, PAN Minhsiung, TAN Di, et al. Chemistry and health effects of polymethoxyflavones and hydroxylated polymethoxyflavones[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1(1)： 2-12.

[2] 王磊, 蘇學素, 付陳梅, 等. 柑橘中多甲氧基黃酮生物活性及應用研究進展[J]. 食品科學, 2009, 30(7)： 285-290.

[3] HUANG Yungsheng, HO Suchen. Polymethoxy flavones are responsible for the anti-inflammatory activity of citrus fruit peel[J]. Food Chemistry, 2010, 119(3)： 868-873.

[4] KIM H G, KIM G S, PARK S, et al. Flavonoid profiling in three citrus varieties native to the Republic of Korea using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry： contribution to overall antioxidant activity[J]. Biomedical Chromatography, 2012, 26(4)： 464-70.

[5] KIM, H G, KIM G S, LEE J H, et al. Determination of the change of flavonoid components as the defence materials of Citrus unshiu Marc fruit peel against Penicillium digitatum by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2011, 128(1)： 549-545.

[6] PAN G G, KILMARTIN P A, SMITH B G, et al. Detection of orange juice adulteration by tangelo juice using multivariate analysis of polymethoxylated flavones and carotenoids[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2002, 82(4)： 421-427.

[7] ESCRICHE I, KADAR M, DOMENECH E, et al. Using flavonoids, phenolic compounds and headspace volatile profile for botanical authentication of lemon and orange honeys[J]. Food Research International, 2011, 44(5)： 1504-1513.

[8] SENTANDREU E, IZPUIERDO L, SENDRA J M. Differentiation of juices from clementine (Citrus clementina), clementine-hybrids and satsuma (Citrus unshiu) cultivars by statistical multivariate discriminant analysis of their flavanone-7-O-glycosides and fully methoxylated flavones content as determined by liquid chromatography[J]. European Food Research and Technology, 2007, 224(4)： 421-429.

[9] 吳桂蘋, 蘇學素, 焦必寧. 柑橘活性成分檢測技術研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(9)： 116-121.

[10] 李煥霞, 吳桂蘋, 王華. 甜橙皮渣膳食纖維中類黃酮化合物含量分析[J]. 飲料工業(yè), 2008, 11(9)： 33-35.

[11] BERMEJO A, LLOSA M J, CANO A. Analysis of bioactive compounds in seven citrus cultivars[J]. Food Science and Technology International, 2011, 17(1)： 55-62.

[12] GREEN C O, WHEATLEY A O, MORRISON E Y, et al. Determination of polymethoxylated flavones in peels of selected Jamaican and Mexican citrus (Citrus spp.) cultivars by highperformance liquid chromatography[J]. Biomedical Chtomatography, 2007, 21(1)： 48-54.

[13] BELAJOVA E, SUHAJ M. Determination of phenolic constituents in citrus juices： method of high performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry, 2004, 86(3)： 339-343.

[14] YU K, LITTLE D, PLUMB R, et al. High-throughput quantification for a drug mixture in rat plasma-a comparison of ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry with highperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20(4)： 544-552.

[15] GRUZ J, NOVAK O, STMAD M. Rapid analysis of phenolic acids in beverages by UPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry, 2008, 111(3)： 789-794.

[16] SPACIL Z, NOVAKOVA L, SOLICH P. Analysis of phenolic compounds by high performance liquid chromatography and ultra performance liquid chromatography[J]. Talanta, 2008, 76(1)： 189-199.

[17] 付陳梅, 吳桂蘋, 蘇學素, 等. 液相色譜法測定柑橘果實中類黃酮方法研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(2)： 121-125.

[18] RAMFUL D, BAHORUN T, BOURDON E, et al. Bioactive phenolics and antioxidant propensity of flavedo extracts of Mauritian citrus fruits： potential prophylactic ingredients for functional foods application[J]. Toxicology, 2010, 278(1)： 75-87.

[19] STALIKAS C D. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids[J]. Journal of Separation Science, 2007, 30(18)： 3268-3295.