帶魚蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解物抗氧化性能

厲 望，靳 挺*，武玉學

(1.浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027；2.浙江大學寧波理工學院生物與化學工程學院，浙江 寧波 315100)

氧化與人類及其他動物的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈硬化等的發(fā)病機理有關(guān)。適當攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過氧化，幫助機體抵御疾病。介于蛋白質(zhì)和氨基酸間的肽類由于結(jié)構(gòu)特點，與其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白質(zhì)等比較，食用安全性更高，具有極強的活性和多樣性，而且容易被吸收利用，同時還具有獨特的生理功能，如降血壓、抗氧化、降低膽固醇、增強免疫力等。其抗氧化性相比于蛋白質(zhì)和氨基酸往往更為顯著，通過蛋白質(zhì)的可控酶解技術(shù)制備天然的抗氧化肽將能很好地解決以上需求[1-3]。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，將有越來越多的抗氧化肽被開發(fā)，作為功能性基料或添加劑應用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)[4]。

水解魚蛋白中蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸比例較高，含有較高水平的微量元素碘和硒，VB2和VB5含量也較為豐富[5]，可作為制取抗氧化肽的理想原料。目前國內(nèi)外有不少研究者用不同種類的蛋白在適當條件下經(jīng)過酶解制備抗氧化活性肽，如侯雅坤等[6]利用核桃蛋白酶解，制備了具有良好抗氧化性的酶解物；Li Lin等[7]水解鳙魚制得抗氧化肽；李俊江等[8]研究鵝肉蛋白酶解物的抗氧化特性及功能特性。本實驗以DPPH自由基清除率為主要指標，水解度為輔助指標，選用4種蛋白酶對帶魚進行酶解，篩選出最適用酶，并優(yōu)化帶魚蛋白的酶解工藝，研究酶解產(chǎn)物的抗氧化特性，旨在為帶魚蛋白制備抗氧化肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶魚，市售，去頭和內(nèi)臟，貯于－20℃冰箱中備用。

堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L，酶活力2.4AU/g)、風味蛋白酶(Flavourzyme，酶活力500LAPU/g)、中性蛋白酶(Neutrase，酶活力0.8AU/g) 丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶(酶活力200萬U/g) 南寧龐博生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1型電動高速組織搗碎機 上海精科實業(yè)有限公司；HHS型恒溫水浴鍋、85-2型恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機器械有限公司；722S型紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Kjeltec 2300凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；DELTA-320pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Sartorius(BP211D)電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Aminosys A200氨基酸自動分析儀 德國安米諾西斯公司。

1.3 方法

1.3.1 帶魚蛋白酶解液的制備

帶魚肉→去頭內(nèi)臟洗凈→按比例加水→攪成肉糜→水浴鍋中酶解并不斷攪拌→90℃水浴中滅酶15min→4000r/min、4℃離心20min→過濾取上清液→酶解產(chǎn)物

1.3.2 酶種類的選擇

分別選用堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、風味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶，確定帶魚、蒸餾水質(zhì)量比1:3，水解時間5h，加酶量1.6%(以魚肉質(zhì)量的百分比計)，按照表1所示，在各蛋白酶最適pH值和溫度條件下進行水解。綜合考慮酶解物DPPH自由基清除率和水解度，篩選出最適用酶。

表 1 各種酶酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of 4 kinds of proteases

1.3.3 蛋白質(zhì)水解度的測定

分別采用中性甲醛滴定法[9]和凱氏定氮法[10]測水解液中氨基態(tài)氮含量和樣品總氮含量，按式(1)計算水解度。

1.3.4 酶解物DPPH自由基清除率的測定

稱取DPPH試劑12.80mg，用50%乙醇溶解，定容轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為256.1mg/L DPPH 儲備液，置于冰箱中備用，使用前用50%乙醇稀釋至質(zhì)量濃度為25.61mg/L。將DPPH溶液室溫條件下靜置10min 后，加入樣品待測液2mL，搖勻，放置一定時間，以乙醇調(diào)零，測定波長517nm處吸光度(Ai)。測定2mL DPPH溶液與2mL 50%乙醇溶液在波長517nm處吸光度(Ao)，測定2mL樣品待測液與2mL 50%乙醇溶液在波長517nm處吸光度(Aj)[11]。每個樣品重復3次，求得清除率平均值。

1.3.5 酶解物還原力的測定

在1mL各濃度樣品中，加入2.5mL質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液和2.5mL 0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)，混勻后在50℃水浴保溫20min，然后加入2.5mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的FeCl3，室溫反應10min后在波長700nm處測其吸光度[12]，吸光度越大則樣品的還原能力越強。

1.3.6 酶解物·OH清除率的測定

取5mmol/L的鄰二氮菲溶液1mL于試管中，依次加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)2mL和蒸餾水1mL、5mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，充分混勻，加0.1%的H2O21mL，于37℃條件下恒溫反應60min，于波長536nm處測其吸光度AP；同前步，以1mL蒸餾水代替其中的H2O2，測得的吸光度Ab；用樣品液1mL代替其中的1mL蒸餾水，測得吸光度As[13]。

1.3.7 響應面分析因素及水平表

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，運用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以酶解溫度(X1)、酶解時間(X2)、加酶量(X3)為變量，展開三因素三水平的響應面試驗，分析因素及水平設(shè)計見表2。

表 2 響應面分析因素及水平Table 2 Analytical factors and levels for response surface methodology

1.3.8 帶魚蛋白酶解物分子質(zhì)量的測定

采用Sephadex G-25凝膠，選用柱管內(nèi)徑15mm，柱長50cm的層析柱。采取標準蛋白對照層析方法測定酶解物的分子質(zhì)量。上樣量1mL，以1/15mol/L pH6.98磷酸鹽緩沖液(含0.15mol/L NaCl洗脫，流速0.5mL/min。標準蛋白分別為BSA、胰凝乳蛋白酶原A、溶菌酶、VB12，分子質(zhì)量分別為67000、25000、14400、1355D，各取10mg用上述磷酸鹽緩沖液定容于10mL容量瓶中。測定各標準樣出峰時間(t)，以出峰時間為橫坐標(x)，標準樣分子質(zhì)量的對數(shù)值(lgM)為縱坐標(y)制作標準曲線。酶解物的分子質(zhì)量(M)由其出峰時間和標準曲線求得。

1.3.9 帶魚蛋白酶解物氨基酸組成分析

按GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸測定》和GB/T 15399—1994 《飼料中含硫氨基酸測定：離子交換色譜法》，在氨基酸自動分析儀上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

酶的專一性決定了某種蛋白酶只作用于某些肽鍵或帶有某種基團的氨基酸所形成的肽鍵。酶種類不同，其底物特異性和作用位點也不同，這決定了酶解產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)和功能，因此需要篩選出能高效作用于低值魚蛋白的蛋白酶。

圖 1 不同蛋白酶解物的DPPH自由基清除率和水解度Fig.1 DPPH radical scavenging rate and hydrolysis degree of the enzymatic hydrolysates obtained by different proteases

由圖1可知，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率較高，風味蛋白酶的水解度最大。各種蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和水解度分別為堿性蛋白酶(46.15%，14.13%)，木瓜蛋白酶(43.38%，14.20%)、風味蛋白酶(35.64%，15.23%)、中性蛋白酶(37.91%，13.37%)。風味蛋白酶是經(jīng)米曲霉發(fā)酵制得真菌蛋白酶和肽酶的復合體，包含內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，主要從肽鏈內(nèi)部或肽鏈末端切斷肽鍵，將多肽水解為低分子小肽和氨基酸，因而水解程度較高。堿性蛋白酶是一種內(nèi)切絲氨酸蛋白酶，主要用于切斷蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)部的肽鍵，生成多肽等中間產(chǎn)物，且可以裂解谷氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸和賴氨酸等羧端肽鍵[14]，其酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率較高。因此綜合考慮抗氧化活性與水解效果，選用堿性蛋白酶作為水解用酶。

2.2 帶魚蛋白酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 酶解時間對DPPH自由基清除率、水解度的影響

在酶解溫度50℃、加酶量1.6%、固液比1:3，調(diào)節(jié)酶解時間3、4、5、5.5、6h，考察酶解時間對DPPH自由基清除率、水解度的影響。由圖2可知，水解度隨著水解時間的增加，呈現(xiàn)上升的趨勢，在6h時達到16.3%。酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解時間的延長逐漸增大，在4h時達到最大值46.15%，之后隨著時間延長開始減小。在反應的開始階段，酶活力高，酶切位點多，反應速率快，水解度顯著增大；隨著酶解時間延長，酶的活性部位被飽和，反應速率降低，水解趨于平緩，多肽逐漸水解為無抗氧化作用的氨基酸，而多肽為清除自由基的主要成分[15]，因而DPPH自由基清除率下降。因此酶解時間以4h左右為宜。

圖 2 酶解時間對DPPH自由基清除率、水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis duration on DPPH radical scavenging rate and hydrolysis degree of resultant hydrolysates

2.2.2 酶解溫度對DPPH自由基清除率、水解度的影響

在固液比1:3、酶解時間3h、加酶量1.6%，調(diào)節(jié)酶解溫度30、40、45、50、55、60℃，考察酶解溫度對DPPH自由基清除率、水解度的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，DPPH自由基清除率與水解度逐漸增大，在50℃時達到最大值，分別為46.15%和14.2%，當溫度高于50℃時，清除率與水解度開始減小。在反應的初始階段，溫度較低，酶活性較低，隨著溫度的升高，體系的內(nèi)能逐漸增大，酶與底物之間的接觸機會增多，酶促反應速率加快，水解度上升，當溫度繼續(xù)升高時，當其所處環(huán)境的溫度高于某一點時，酶蛋白的特定結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，酶的活性也會降低甚至失活，此時水解度開始下降，因此酶催化反應要有一個適宜的溫度[16]。酶解溫度以50℃左右為宜。

圖 3 酶解溫度對DPPH自由基清除率、水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rate and hydrolysis degree of resultant hydrolysates

2.2.3 加酶量對DPPH自由基清除率、水解度的影響

在酶解溫度50℃、酶解時間3h、固液比1:3，調(diào)節(jié)加酶量0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，考察加酶量對DPPH自由基清除率、水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著加酶量增大，相應DPPH自由基清除率顯著增大，在加酶量為1.6%時達最大值55.37%，而后逐漸減小。水解度隨著加酶量的增加顯著增大，在加酶量大于1.2%時，變化趨于平穩(wěn)。加酶量增加雖然可以提高蛋白質(zhì)水解速率，但同時也增加了水解液中的抗氧化肽段被降解成無抗氧化作用的小肽段及游離氨基酸的幾率[17]。綜合考慮酶的使用成本，加酶量以1.6%為宜。

圖 4 加酶量對DPPH自由基清除率、水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme addition amount on DPPH free radical scavenging rate and hydrolysis degree of resultant hydrolysates

2.2.4 響應面優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗得到的結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解時間、加酶量3個因素，以DPPH自由基清除率為響應值，設(shè)計三因素三水平的響應面試驗，見表3。堿性蛋白酶酶解帶魚蛋白的工藝優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計進行了15組試驗，其中1～12組為析因點和零點試驗，13～15組為中心點重復試驗。利用Design-Expert8.0.7軟件對DPPH自由基清除率與各水解因素進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=59.647－1.99X1+0.705X2－4.07X3－2.68X1X2+0.895X1X3+3.225X2X3－8.143X12－4.253X22－7.303X32，方差分析結(jié)果見表4。

表 3 Box-Beknhen中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Beknhen tests

表 4 DPPH自由基清除率為響應值的二次多項式模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model describing DPPH radical scavenging rate

由表4可知，回歸方程R2=0.9757，RAdj2=0.9627，說明該模型方程有很好的精密度，回歸效果較好，可信度高；失擬項不顯著(P=0.6507＞0.05)，表明該模型擬合程度良好，因此以該模型優(yōu)化帶魚蛋白的酶解工藝是合適的，能很好地預測酶解各因素對DPPH自由基清除率的影響。

試驗中一次項X1(酶解溫度)、X3(加酶量)及交互項X2X3(酶解時間和加酶量)，X1X2(酶解溫度和酶解時間)和全部二次項影響較為顯著，各個因素對DPPH自由基清除率的影響不是簡單的線性關(guān)系。由F值可知，酶解溫度和加酶量對結(jié)果影響較大，酶解時間影響較小。

響應面圖形是響應值對應自變量酶解溫度、酶解時間、酶用量所構(gòu)成的一個三維空間圖，可直觀地反映出各自變量對響應值的影響。利用二次多項式回歸方程和Box-Behnken試驗所得的結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.7軟件作圖分析(圖5)，可以看出清除率存在最高點。對上述回歸方程求解，可得X1=0.1272，X2=－0.0654，X3=－0.2853，Y有最大值，即蛋白酶解物清除DPPH自由基的最佳條件組合為：酶解溫度48.57℃、酶解時間3.81h、加酶量1.65%、固液比1：3，此時DPPH自由基清除率為59.81%。為了驗證模型預測的準確性，在酶解溫度48℃、酶解時間3.8h、加酶量1.65%、固液比1：3的條件下進行實驗，實際測得的DPPH自由基清除率為60.13%，實測值和最佳理論值誤差在±1%以內(nèi)，可見該模型能較好地預測帶魚蛋白酶解物清除DPPH自由基的情況。

圖 5 各因素交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Response surface plots for the effects of the cross-interactions among different variables on DPPH radical scavenging rate

2.3 酶解物的還原力和對·OH的清除率

在2.2節(jié)所得優(yōu)化條件下酶解帶魚蛋白，測定酶解物的還原力和對·OH的清除率。由圖6可知，酶解起始階段，酶解物還原力和對·OH的清除率隨著酶解時間的延長而增大，在酶解3.8h時達到最大；但隨著酶解的繼續(xù)開始減小。這與前述結(jié)論多肽逐漸水解成無抗氧化作用的氨基酸導致抗氧化能力下降是相符的。可見所得酶解物具有良好的還原力和對·OH清除能力，表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

圖 6 酶解物還原力和清除·OH的能力Fig.6 Reducing power and hydroxyl radical scavenging rate of resultant hydrolysates

2.4 帶魚蛋白酶解物的分子質(zhì)量

圖 7 帶魚蛋白酶解物層析譜圖Fig.7 Sephadex G-25 chromatographic pattern of optimal hairtail protein hydrolysates

經(jīng)測定，標準曲線方程為y=5.7 4 7 0－0.0 3 1 3 t (R2=0.9829)。由圖7可知，酶解物的出峰時間為84min，由標準曲線方程計算得樣品帶魚蛋白酶解液的分子質(zhì)量為1311D。范建鳳等[18]研究了蟹抗氧化肽的分離純化，蟹抗氧化肽經(jīng)Sephadex G-25凝膠分離得到3種組分，其中分子質(zhì)量為1096.5D的組分抗氧化活性較強；據(jù)文獻[19-20]報道，分子質(zhì)量低于3000D的多肽不僅容易吸收，加工性能好，易與其他調(diào)料協(xié)調(diào)搭配，而且還顯示出良好的如降血脂、抗氧化等生理活性。本研究帶魚蛋白酶解物分子質(zhì)量在3000D以下，層析圖中只出現(xiàn)1個洗脫峰，分子質(zhì)量較為接近，可見帶魚蛋白具有開發(fā)制備抗氧化產(chǎn)品的潛力。

2.5 帶魚蛋白酶解物氨基酸組成分析

將經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析收集的洗脫峰樣品進行氨基酸組成分析，結(jié)果如表5所示。酶解產(chǎn)物含有蘇氨酸、亮氨酸、賴氨酸和蛋氨酸等人體必需氨基酸，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的37.13%；據(jù)文獻[21]報道，丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸對清除自由基有較好的效果，經(jīng)計算上述氨基酸含量占總氨基酸含量的35.1%；帶魚蛋白酶解物構(gòu)成肽的氨基酸含量占總氨基酸含量的89.8%，含量較為豐富，因此低分子肽為帶魚蛋白酶解物的主要成分。

表 5 酶解物氨基酸組成分析Table 5 Amino acids compositions of the hydrolysates

3 結(jié) 論

以DPPH自由基清除率為主要指標，水解度為輔助指標，分別選用堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，在各自最適pH值和溫度條件下對帶魚蛋白進行酶解，其中堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率較高。因此綜合考慮抗氧化能力和水解效果，選用堿性蛋白酶作為實驗用酶。通過響應面優(yōu)化試驗得到，堿性蛋白酶水解帶魚蛋白所得酶解液清除DPPH自由基的最佳條件為酶解溫度48℃、加酶量1.65%、酶解時間3.8h、固液比1:3，清除率達到60.13%；所得酶解物具有良好的還原力和對·OH的清除能力，分子質(zhì)量為1311D；酶解物含有清除自由基作用較好的氨基酸，構(gòu)成肽的氨基酸含量占總氨基酸含量的89.8%，低分子肽為帶魚蛋白酶解物的主要成分。由此看來，帶魚蛋白酶解物對DPPH自由基和·OH有很好的清除作用，且有較好的還原力，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，為帶魚蛋白制取天然抗氧化肽提供了理論依據(jù)。

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