小米米糠中抗癌細(xì)胞增殖活性蛋白的分離純化

單樹花，武海麗，李宗偉，袁琳潔，趙文彬，劉慶午，郭茂林，李卓玉,*

(1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 030031)

腫瘤是危害人類健康的嚴(yán)重疾病之一。雖然腫瘤的治療取得了很大的進(jìn)展，但抗癌化學(xué)藥物在治療癌癥的同時(shí)，對(duì)人體本身也會(huì)產(chǎn)生很大的毒副作用。很多病人在治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，或因反復(fù)用藥產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找療效高、毒性低的天然抗癌成分，一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。大量研究表明，許多天然產(chǎn)物中含有低毒、高效的抗腫瘤活性成分，如黃酮、生物堿類、揮發(fā)油類、萜類、苷類等一些小分子物質(zhì)[1]。近年來隨著分子生物學(xué)、分子腫瘤學(xué)、現(xiàn)代提取分離和分析測(cè)試技術(shù)的發(fā)展，一些抗腫瘤的活性多肽，如：大米米糠和苦瓜中的多肽[2-5]和一些植物蛋白(如：遼東楤木[6]、毛蚶[7]、桑黃菌[8])已經(jīng)從天然產(chǎn)物中篩選出來，這對(duì)抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)具有重要的意義。

谷子，即小米或粟(Setaria italica)，英文名(foxtail millet)，一年生禾本科屬植物，起源于我國黃河流域。小米米糠是小米經(jīng)壟谷脫殼，碾米等加工成精米過程中得到的副產(chǎn)品。小米米糠中含有豐富的甘油三酯、脂蛋白、谷維醇、VB、VE、葡萄糖、纖維素以及微量元素等，能夠排出人體內(nèi)的毒素，有健腦、補(bǔ)腎、強(qiáng)身、抗癌等作用，經(jīng)常食用小米米糠，可以增強(qiáng)人體的免疫功能，防病健身[9]。目前由于小米米糠的口感不佳，主要被用作飼料，或被作為廢棄物處理，所以小米米糠資源的深度開發(fā)和有效利用將會(huì)帶來很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，目前國內(nèi)外關(guān)于小米米糠的研究主要集中在其化學(xué)成分和營養(yǎng)價(jià)值方面[10]，而未見關(guān)于小米米糠抗腫瘤活性蛋白的報(bào)道。本研究中， 以純天然小米米糠為原料，制備并純化小米米糠中的有效活性蛋白，并對(duì)其抗腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行研究，從而為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也促進(jìn)小米米糠的深度開發(fā)和這一資源的有效增值利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

小米米糠(Setaria italica)由山西省天下谷股份有限公司提供。

人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、和人正常肝細(xì)胞株HL-7702，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Thermo Scientific Hyclone公司；無支原體胎牛血清 武漢博士德生物工程有限公司；噻唑藍(lán)(MTT) 北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO) 美國Amresco公司；胰蛋白酶 北方同正公司；青鏈霉素(100X) 碧云天生物技術(shù)研究所；Protein Marker 生工生物工程(上海)股分有限公司；苯甲酰-DL-Arg-P-硝基酰替苯胺鹽酸鹽(BAPA) 上海三杰生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)細(xì)胞熒光染色凋亡顯示試劑盒 北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；Q柱和SP柱介質(zhì)材料 美國GE公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

5417離心機(jī) 德國Eppendorf公司；756MC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；Milli-QA10超純水儀、超濾管 美國Millipore公司；微量Gilson加樣器 法國Gilson公司；凝膠電泳儀、Microplate Reader Model 550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國Bio-Rad公司；inoLad Multi 720酸度計(jì) 德國WTW公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Hyclone公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 小米米糠粗蛋白的制備及純化

取30g干燥的谷糠，粉碎，按1:5(m/V)的量加入蛋白提取液(20mmol/L Tris-HCl，含0.85% NaCl，1mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH8.0)，4℃條件下放置過夜，11000r/min離心30min，取上清，加入2倍體積的－20℃預(yù)冷的丙酮，于－20℃沉淀1h，11000r/min離心30min，棄上清，沉淀在－20℃條件下放置20min，使丙酮完全揮發(fā)。將沉淀用pH8.0、20mmol/L的Tris-HCl緩沖液溶解，11000r/min離心30min，取上清即為小米米糠粗蛋白。向上清液中先加入30%飽和度的硫酸銨粉末溶解后，靜置30min，11000r/min離心，收集上清液，再向上清液中加入85%飽和度的硫酸銨粉末溶解后，靜置30min，11000r/min離心，收集沉淀，用Tris-HCl緩沖液溶解、透析、濃縮即得到小米米糠中抗腫瘤粗蛋白。

將小米米糠抗腫瘤粗蛋白進(jìn)行Q-陰離子交換層析，收集穿透液；再將穿透液進(jìn)行SP-陽離子柱交換層析，先用40mmol/L的Tris-NaCl緩沖液(pH8.0，20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中含有40mmol/L的NaCl)洗脫，去雜蛋白；再用100mmol/L的Tris-NaCl緩沖液(pH8.0，20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中含有100mmol/L的NaCl)洗脫，紫外檢測(cè)儀于280nm波長檢測(cè)，收集洗脫峰，將此洗脫液在80℃水浴中孵育15min熱變性法進(jìn)一步去雜蛋白，即得到具有抗腫瘤的小米米糠活性純蛋白。

1.2.2 蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)樣品的蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。以1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)配成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的蛋白質(zhì)量濃度梯度，在595nm波長處測(cè)定溶液的吸光度，以A595nm為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品20μL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 蛋白質(zhì)表觀分子質(zhì)量的測(cè)定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測(cè)定蛋白質(zhì)的表觀分子質(zhì)量，12%分離膠，進(jìn)行恒壓電泳，濃縮膠的電壓為60～80V，分離膠的電壓為80～120V。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人正常肝細(xì)胞株HL-7702均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(含100U/mL青鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用MTT法。選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔8000個(gè)細(xì)胞/100μL培養(yǎng)液，加到96孔培養(yǎng)板中。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后取出培養(yǎng)板，加入不同質(zhì)量濃度的小米米糠純蛋白20μL，使其終質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1μg/μL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔。培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，取出培養(yǎng)板，每孔加入20μL 5.0mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去板中培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO，振蕩均勻，于波長570nm處測(cè)定各孔光吸光度。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)

常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代各細(xì)胞，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104個(gè)/孔(每孔1mL)，接種到30mm×30mm的小皿中，待細(xì)胞貼壁后，吸掉舊培養(yǎng)基，加入1mL新鮮培養(yǎng)基和200μL的 0.1μg/μL小米米糠蛋白，處理48h，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并掃描細(xì)胞核的形態(tài)(×60)，照相。

1.2.7 數(shù)據(jù)整理

2 結(jié)果與分析

2.1 小米米糠中抗腫瘤活性蛋白的分離純化

表 1 FMB蛋白的分離純化Table 1 Purification of FMB protein

圖 1 SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白的分離純化Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified target protein

上圖各個(gè)泳道顯示了小米米糠蛋白的純化過程。首先采用丙酮沉淀法提取該小米米糠粗蛋白(泳道1)，隨后用30%～85%飽和度的硫酸銨沉淀活性蛋白組分(泳道2)，再將該組分過Q-陰離子交換層析柱，發(fā)現(xiàn)活性蛋白成分在穿透液里(泳道3)。將上述穿透液上樣于SP-陽離子交換層析柱，先用pH8.0、40mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗柱，洗掉雜蛋白，再用pH8.0 100mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗柱，收集此洗脫峰，即為具抗腫瘤活性的蛋白(泳道4)，最后將該蛋白在80℃的水浴中孵育15min熱變性法進(jìn)一步去雜蛋白，得到電泳純的活性蛋白(泳道5)，其表觀分子質(zhì)量約為35kD左右，將該蛋白命名為FMB。

2.2 小米米糠中抗腫瘤活性蛋白組分對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響

圖 2 谷糠活性粗蛋白對(duì)DLD1、HL-7702細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of the crude protein extract and its fractions at different saturation degrees of ammonium sulfate on the growth of DLD1 and HL-7702 cells

圖 3 圖2中蛋白組分2對(duì)DLD1細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of active components chromatographically separated from fraction 2 (as shown in Fig.2) on the growth of DLD1 cells

圖 4 Q-柱得到的活性蛋白組分2-1對(duì)DLD1細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of active components chromatographically separated from fraction 2-1 on the growth of DLD1 cells

圖 5 蛋白組分2-1-3分別用不同溫度孵育后對(duì)DLD1細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on the growth inhibitory activity of active component 2-1-3 against DLD1 cells

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，通過體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小米米糠蛋白中的有效成分，用小米米糠分離過程中的各級(jí)蛋白作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1和人正常肝細(xì)胞株48h。MTT結(jié)果(圖2)顯示，30%～85%飽和度的硫酸銨分級(jí)沉淀所得到的谷糠蛋白對(duì)DLD1細(xì)胞有明顯抑制作用，所以該級(jí)蛋白中可能含有抗腫瘤活性組分；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，各級(jí)蛋白對(duì)正常細(xì)胞HL-7702均無明顯抑制作用。圖3結(jié)果進(jìn)一步表明，小米米糠蛋白活性成分在Q-陰離子柱分離時(shí)的穿透液里。將此穿透液過SP柱，100mmol/L的Tris-NaCl洗脫液被檢測(cè)到具較顯著的抗腫瘤活性(圖4)。SDS-PAGE結(jié)果表明，該組分主要為一條35kD的蛋白條帶(圖1)。為了進(jìn)一步純化該蛋白，將該蛋白分別在37、60、80、100℃的水浴中孵育15min，發(fā)現(xiàn)該蛋白仍具有細(xì)胞活性(圖5)，且通過此步驟得到進(jìn)一步的純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示為單一條帶，見圖1的泳道5。

2.3 不同質(zhì)量濃度的小米米糠活性蛋白對(duì)各種腫瘤細(xì)胞增殖活力的影響

圖 6 不同質(zhì)量濃度的小米米糠活性蛋白對(duì)細(xì)胞株HL-7702、DLD1、HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of FMB concentration treatment on the growth of HL-7702, DLD1 and HeLa cells

為了比較FMB對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響，采用不同質(zhì)量濃度(0.025、0.050、0.075、0.100μg/μL)的FMB分別作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人正常肝細(xì)胞HL-7702。由圖6可知，F(xiàn)MB對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制能力各不相同，其中對(duì)DLD1細(xì)胞株的抑制作用最顯著，HeLa細(xì)胞株次之；且隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，抑制率也逐漸增強(qiáng)，具有明顯的劑量依賴性；而對(duì)正常細(xì)胞株HL-7702無明顯抑制作用。如圖6結(jié)果所示，當(dāng)FMB的終質(zhì)量濃度為0.1μg/μL時(shí)，體外處理上述各細(xì)胞株48h后，DLD1細(xì)胞生長抑制率為44%，HeLa細(xì)胞生長抑制率為37%，HL-7702細(xì)胞抑制率為7.7%。在表2中顯示了經(jīng)FMB處理后，獲得的各種細(xì)胞的IC50值，DLD1細(xì)胞的IC50值最小，HL-7702細(xì)胞株的IC50值最大。

表 2 FMB對(duì)腫瘤細(xì)胞(DLD1、HeLa)和正常細(xì)胞(HL-7702)毒性的影響Table 2 Cytotoxic activity of FMB against various human cancer cell lines (DLD1 and HeLa) and a normal cell line (HL-7702)

2.4 小米米糠抗腫瘤活性蛋白對(duì)不同細(xì)胞株形態(tài)特征的影響

圖 7 倒置顯微鏡下觀察FMB處理后HL-7702、DLD1和HeLa細(xì)胞的形態(tài)特征(×60)Fig.7 Morphological observation of HL-7702, DLD1 and HeLa cells after FMB treatment under an inverted microscope (×60)

倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各細(xì)胞的形態(tài)特征(圖7)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)FMB蛋白處理48h后的DLD1和HeLa細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細(xì)胞核明顯皺縮，變圓，部分細(xì)胞漂浮等凋亡現(xiàn)象；而對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，HeLa細(xì)胞呈多角形，胞漿豐富，核明顯可見核仁。DLD1細(xì)胞樹突狀明顯，細(xì)胞均一，生長良好。而正常細(xì)胞株HL-7702在處理前后細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化。

3 討 論

小米米糠作為農(nóng)副產(chǎn)品，其營養(yǎng)價(jià)值豐富，來源充足、價(jià)格低廉，但目前由于人們對(duì)其價(jià)值缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，造成了大量的小米麩皮資源的浪費(fèi)，若能將其充分利用，將具有很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)價(jià)值。本研究以純天然小米米糠為原料，通過丙酮和硫酸銨沉淀法制備了米糠粗蛋白，并通過離子交換層析法和蛋白的熱穩(wěn)定性純化出了單一FMB。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：該蛋白能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1和宮頸癌細(xì)胞株HeLa的增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡；而對(duì)人正常肝細(xì)胞株HL-7702無明顯作用。因此，F(xiàn)MB有望成為綠色、高效的天然抗癌藥物。

3.1 小米米糠中活性蛋白的制備及純化

表1的數(shù)據(jù)表明，30g的谷糠原材料經(jīng)過一系列的制備、純化過程后能獲得3.1mg的谷糠活性純蛋白，得率較低。因此，在以后的蛋白純化中，將不斷優(yōu)化純化程序，以期大幅度的提高其得率，為以后的深入研究和開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在純化小米米糠活性蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MB在pH8.0的緩沖溶液體系中能與SP-陽離子交換層析柱結(jié)合，由此初步推測(cè)該蛋白可能為堿性蛋白。當(dāng)用100mmol/L的Tris-NaCl洗脫液洗脫與蛋白結(jié)合的層析柱時(shí)，該蛋白被洗脫下來，因而推測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)大約在8.5左右。另外，蛋白熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)MB在80℃的水浴中孵育15min后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白不但未發(fā)生降解，而且其純度進(jìn)一步提高；將FMB分別在37、60、80、100℃的水浴中孵育15min后，進(jìn)行體外抗癌細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白仍具有較強(qiáng)的抗癌細(xì)胞增殖的活性。這說明，本研究純化獲得的FMB的分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的耐熱性，這有利于我們進(jìn)一步研究其生物活性及作用機(jī)制，同時(shí)也有利于進(jìn)行大規(guī)模的分離純化。

3.2 小米米糠活性蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有密切的關(guān)系。大多數(shù)抗腫瘤藥物都能抑制敏感腫瘤細(xì)胞的增殖，并且其抗腫瘤效果與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞增殖抑制的活性有關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，探討了小米米糠活性蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞株DLD1、HeLa及正常細(xì)胞株HL-7702增殖的影響，同時(shí)比較了各種細(xì)胞抑制率的IC50。IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，該數(shù)值越低，表明細(xì)胞對(duì)藥物處理越敏感。本研究中FMB對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1的抑制作用最強(qiáng)，IC50值最小，HeLa次之。這說明，F(xiàn)MB對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在一定差異，它對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1的生長抑制作用顯著，有望為結(jié)腸癌的治療提供新的靶向藥物。特別是FMB對(duì)HL-7702細(xì)胞生長基本無抑制作用，表明FMB具有特異的抑制癌細(xì)胞增殖的作用，它對(duì)正常細(xì)胞無明顯抑制作用。

3.3 小米米糠活性蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

人類惡性腫瘤形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)是腫瘤細(xì)胞異常增殖、凋亡嚴(yán)重減退造成的。就細(xì)胞內(nèi)調(diào)控調(diào)節(jié)機(jī)制而言，既須拮抗、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或誘導(dǎo)促使腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。許多人類惡性腫瘤是由于細(xì)胞的死亡過程嚴(yán)重受阻，使得腫瘤細(xì)胞在數(shù)量上無限制惡性增生。越來越多的證據(jù)表明，化療藥物對(duì)腫瘤的作用主要是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[13-15]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FMB蛋白能促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，尤其對(duì)DLD1細(xì)胞作用顯著。在倒置顯微鏡下可以觀察到，經(jīng)FMB處理48h后的DLD1細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯皺縮、變圓、部分細(xì)胞漂浮等典型的凋亡信號(hào)；而對(duì)正常肝細(xì)胞株HL-7702卻無明顯影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，F(xiàn)MB能顯著誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯影響。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明來源于小米米糠中的活性蛋白不但具有較強(qiáng)的抗癌細(xì)胞增殖的能力，而且還能顯著誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，但對(duì)人正常細(xì)胞卻無明顯作用。該蛋白是通過何種細(xì)胞通路實(shí)現(xiàn)這一功能其作用靶點(diǎn)及具體分子機(jī)制又如何，這些問題都有待進(jìn)行進(jìn)一步的深入探討，以期為癌癥的低毒、高效治療提供新的靶向藥物。

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