1,3-二氯-2-丙醇對睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C活性及孕酮合成的影響

白 順，孫建霞，白衛(wèi)濱*，鄒飛雁，張齊好，黃亞東

(1.暨南大學(xué)發(fā)育與再生生物學(xué)系，廣東 廣州 510632；2.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；4.暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510632)

食品中的氯丙醇的污染主要來自以鹽酸水解蛋白工藝生產(chǎn)的醬油、“雞精”等人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷恼{(diào)味品[1-3]。2001年經(jīng)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)綜合評價(jià)得出氯丙醇類同系物1,3-二氯-2-丙醇(1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP)可引起肝臟和腎臟毒性[3-4]，并具有遺傳毒性、發(fā)育毒性和致癌性[5-7]，因此國際上各主要國家對調(diào)味品乃至食品中氯丙醇都有一定的限量標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。此前Omura等[10]給予大鼠長期喂食含1,3-DCP的水后發(fā)現(xiàn)其能降低精子數(shù)，說明1,3-DCP是大鼠的睪丸毒物，對生殖系統(tǒng)有一定的潛在影響，但其具體的毒理機(jī)制尚不明確。本研究通過1,3-DCP對體外培養(yǎng)的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C毒性損傷情況，探討氯丙醇引起的生殖毒性機(jī)制，為氯丙醇的食品安全評價(jià)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

R2C細(xì)胞由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心提供。

1,3-DCP(#1100996，純度為98%) 上海晶純公司；F12培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清、馬血清、肌氨酸鈉 美國Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) 美國Amresco公司；EDTANa2、Triton X-100、Tris 美國Genview公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖 美國FMC公司；正常熔點(diǎn)瓊脂糖 西班牙Biowest公司；孕酮放射免疫試劑盒 北京北方生物技術(shù)研究所。

CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；GC-1200 γ放射免疫計(jì)數(shù)儀 安徽中科中佳公司；DDL-5低溫離心機(jī) 上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測1,3-DCP對R2C細(xì)胞增殖率

取對數(shù)期的R2C細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為2×104個(gè)/mL，以每孔200μL細(xì)胞懸液接種96孔板。培養(yǎng)24h后加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的1,3-DCP，使每孔終濃度分別為0.5、1、2、4、6mmol/L并混合均勻。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，并設(shè)有空白組(只加200μL培養(yǎng)基)和對照組(加200μL細(xì)胞懸液，不加藥)。藥物作用48h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去孔內(nèi)液體，每孔加200μL DMSO溶解沉淀后于脫色搖床搖勻10min，酶標(biāo)儀檢測570nm波長處的吸光度。按下式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

通過SPSS軟件分析得出1,3-DCP刺激細(xì)胞48h后的IC25、IC50和IC75。

1.2.2 單細(xì)胞電泳法(single cell gel electrophoresis，SCGE)檢測1,3-DCP對R2C細(xì)胞DNA損傷作用

R2C細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，以每孔1mL接種到6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24h后加1,3-DCP，使其終濃度為IC25、IC50和IC75。培養(yǎng)4h后收獲細(xì)胞，PBS重懸，冷卻用于SCGE實(shí)驗(yàn)。

配制0.8%常溫熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，加熱熔化后，冷卻至45℃，取100μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，4、10min后取下蓋玻片作為第一層；取104個(gè)細(xì)胞與75μL 0.8%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液在37℃條件下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4℃、10min后取蓋玻片形成第二層膠。

將玻片浸入預(yù)冷的裂解液(2.5 m o l/L N a C l，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris，1% Triton X-100及10% DMSO組成，臨用前配用，pH10)，4℃靜置1h。取出玻片，蒸餾水洗3次后放入電泳槽內(nèi)，加電泳液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH13)并使電泳液面高出玻片0.25cm，靜置20min后25V 200mA電泳15～20min。取玻片置于0.4mol/L Tris(pH7.5)溶液中洗滌3次，每次10min。每片滴加20μL 25μg/mL EB進(jìn)行DNA染色，蓋上蓋玻片后熒光顯微鏡下觀察拍照。CASP軟件分析電泳結(jié)果。

1.2.3 放射免疫(radioimmunoassav，RIA)檢測1,3-DCP對R2C細(xì)胞合成孕酮的影響

R2C細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，以每孔1mL細(xì)胞懸液接入6孔板，培養(yǎng)24h后更換分別含IC25、IC50和IC75濃度1,3-DCP的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)4h或24h后胰酶消化細(xì)胞，1500r/min離心5min后收取上清，放于－20℃保存。按孕酮放射免疫試劑盒進(jìn)行孕酮的測定。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS軟件19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析結(jié)果，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 1,3-DCP對R2C細(xì)胞的生長抑制作用

圖 1 不同濃度1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞48h后的細(xì)胞形態(tài)圖(×200)Fig.1 Morphology of R2C cells subjected to treatment of 1,3-DCP at various concentrations for 48 h (×200)

不同濃度的1,3-DCP作用R2C細(xì)胞48h后，細(xì)胞生長受到不同程度的抑制。由圖1可知，隨著濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均發(fā)生了變化。細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，且貼壁不穩(wěn)定，隨著濃度的增加，此現(xiàn)象越明顯，同時(shí)細(xì)胞抑制率隨著1,3-DCP濃度的增大也逐漸增大(表1)。通過SPSS軟件分析得出1,3-DCP對R2C細(xì)胞的IC25、IC50、IC75分別為(1.161±0.046)、(1.897±0.018)、(3.100±0.040)mmol/L。

表 1 不同濃度1,3-DCP對R2C細(xì)胞生長抑制率的影響Table 1 Inhibitory effect of 1,3-DCP on the growth of R2C cells

2.2 1,3-DCP對R2C細(xì)胞DNA損傷的作用

圖 2 不同濃度1,3-DCP刺激4h后對R2C細(xì)胞DNA損傷作用Fig.2 Damage of DNA in R2C cells after treatment with 1,3-DCP

圖 3 不同濃度1,3-DCP刺激4h后對R2C細(xì)胞尾部DNA含量、尾長、Olive尾距(OTM)的影響Fig.3 Effect of 1,3-DCP on tail DNA content, tail length and Olive tail moment in R2C cells

不同濃度1,3-DCP刺激R2C細(xì)胞4h后，細(xì)胞拖尾的長度隨著濃度的增加而增大(圖2)。通過CASP軟件分析尾部DNA含量、尾長、尾距以及Olive尾距(OTM)等數(shù)據(jù)得出(圖3)，各濃度組對細(xì)胞DNA有明顯的損傷作用，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 1,3-DCP對R2C細(xì)胞分泌孕酮的影響

放射免疫結(jié)果顯示，不同濃度1,3-DCP作用R2C細(xì)胞4h后，各濃度組能夠明顯影響R2C細(xì)胞孕酮的合成(圖4)。而在作用24h后，各濃度組孕酮合成量顯著降低，且隨著濃度的增加，降低也更明顯，各濃度組與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)(圖5)。

圖 4 不同濃度1,3-DCP刺激4h后對R2C細(xì)胞孕酮合成的影響Fig.4 Effect of 1,3-DCP on progesterone production of R2C cells for 4 h

圖 5 不同濃度1,3-DCP刺激24h后對R2C細(xì)胞孕酮合成的影響Fig.5 Effect of 1,3-DCP on progesterone production of R2C cells for 24 h

3 討 論

前期研究[11]發(fā)現(xiàn)氯丙醇毒性作用的靶器官為腎臟和生殖系統(tǒng)。目前，1,3-DCP的毒性和致癌性實(shí)驗(yàn)資料顯示，1,3-DCP可以顯著的增加肝臟、腎臟等惡性腫瘤的發(fā)生[12]。一系列細(xì)菌和哺乳動(dòng)物體外系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中均表明1,3-DCP具有體外致突變作用和遺傳毒性作用[13]。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，1,3-DCP對大鼠雄性生殖系統(tǒng)具有毒性，但未對睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外毒理評價(jià)[10]，本研究通過對睪丸間質(zhì)細(xì)胞R2C的生物活性及其功能的影響來探討1,3-DCP的毒性作用。

1,3-DCP刺激劑量的選擇是依據(jù)Ramy等[14]對氯丙醇的另一同系物3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)的研究來確定劑量范圍。3-MCPD與1,3-DCP都有生殖毒性和致癌性，且1,3-DCP體外研究目前還比較少，因此本實(shí)驗(yàn)參考3-MCPD的刺激劑量范圍來探討1,3-DCP的毒性作用。

研究首先發(fā)現(xiàn)1,3-DCP能抑制R2C細(xì)胞的增殖，并且隨著濃度的增加，抑制也越來越明顯，推測1,3-DCP可能是通過影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活性來影響生殖系統(tǒng)的正常運(yùn)行。此外，單細(xì)胞電泳結(jié)果表明1,3-DCP作用的R2C細(xì)胞與對照組相比DNA受到明顯的損傷，這說明了其對睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有遺傳毒性作用。孕酮是睪酮合成的第一步，通過檢測孕酮水平可間接說明睪酮的分泌量[15-16]。有研究[17]表明，體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞4h時(shí)睪酮分泌量達(dá)到最大，本實(shí)驗(yàn)首先檢測1,3-DCP作用R2C細(xì)胞4h后孕酮的分泌量，同時(shí)也設(shè)置了24h時(shí)間點(diǎn)，目的是探討1,3-DCP對R2C細(xì)胞孕酮分泌量的影響有沒有時(shí)間依賴性。研究結(jié)果顯示1,3-DCP刺激4h或24h后，各濃度組R2C細(xì)胞合成的孕酮與對照組有明顯差異，濃度越高，差異也越明顯。結(jié)果說明1,3-DCP能抑制R2C細(xì)胞孕酮的合成，進(jìn)而抑制睪酮的合成，且抑制呈時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)。

通過以上結(jié)果可猜測，1,3-DCP是通過對R2C細(xì)胞孕酮合成過程中關(guān)鍵蛋白DNA的損傷來達(dá)到影響孕酮合成的作用。今后準(zhǔn)備通過對孕酮合成中關(guān)鍵蛋白的mRNA水平和蛋白水平的研究來進(jìn)一步探討1,3-DCP的毒性作用機(jī)理，從而為闡明1,3-DCP調(diào)控睪丸間質(zhì)細(xì)胞孕酮分泌具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[1] 王衛(wèi)華, 徐銳鋒, 劉軍, 等. 食品中氯丙醇測定方法研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2007, 16(3): 74-76.

[2] NYMAN P J, DIACHENKO G W, PERFETTI G A. Survey of chloropropanols in soy sauces and related products[J]. Food Additives and Contaminants, 2003, 20: 909-915.

[3] STEPHEN W C, KWONG K P, JOAN C W, et al. Chloropropanols levels in foodstuffs marketed in Hong Kong[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(7): 569-573.

[4] SHIOZAKI T, MIZOBATA Y, SUGIMOTO H, et al. Fulminant hepatitis following exposure to dichlorohydrin report of two cases[J]. Human & Experimental Toxicology, 1994, 13: 267-270.

[5] YANN G, ROBERT B, BEATRICE S, et al. Carcinogenicity of chemicals in industrial and consumer products, food contaminants and flavourings, and water chlorination byproducts[J]. The Lancet Oncology, 2011, 12(4): 328-329.

[6] LEE J C, SHIN I S, AHN T H, et al. Developmental toxic potential of 1,3-dichloro-2-propanol in Sprague-Dawley rats[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2009, 53: 63-69.

[7] Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Safety evaluation of certain food additives and contaminants/prepared by the sixty-seventh meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA)[C]. WHO Food Additives Series, 2007: 209-238.

[8] 張燁, 丁曉雯. 食品中氯丙醇污染及其毒性[J]. 糧食與油脂, 2005(7): 44-46.

[9] 李吉平, 高宏偉, 劉文森, 等. 小口徑毛細(xì)管色譜柱測定醬油中三種氯丙醇含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(9): 473-477.

[10] OMURA M, HIRATA M, ZHAO M, et al. Comparative testicular toxicities of two isomers of dichloropropanol, 2,3-dichloro-l-propanol, and 1,3-dichlo-ro-2-propanol, and their metabolites alpha-chlorohydrin and epichlorohydrin, and the potent testicular toxicant 1,2-dibromo-3-chloropropane[J]. Bulletin of Environmental Contamination Toxicology, 1995, 55(1): 127.

[11] 李寧, 劉澤欽, 賈旭東, 等. 氯丙醇對大鼠的毒性研究[J]. 衛(wèi)生研究, 2003, 32(4): 349-352.

[12] KLUWE W M, GUPTA B N, LAMB J C. The comparative effects of 1,2-dibromo-3-chloropropane(DBCP) and its metabolites 3-chloro-1,2-propaneoxide(epichlorohydrin),3-chloro-,1,2-propanediol(alphachlorohydrin), and oxalic acid, on the urogenital system of male rats[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1983, 70: 67-86.

[13] 戴瀅. 國際上對(含氯丙醇)鹽酸水解蛋白的安全性評價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J]. 食品信息指導(dǎo), 1999(12): 31-32.

[14] RAMY R E, ELHKIM M O, LEZMI S, et al. Evaluation of the genotoxic potential of 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) and its metabolites, glycidol and β-chlorolactic acid, using the single cell gel/comet assay[J]. Food and Chemical, 2007, 45: 41-48.

[15] ZHANG Qihao, ZOU Ping, ZHAN Haichao, et al. Dihydrolipoamide dehydrogenase and cAMP are associated with cadmium-mediated Leydig cell damage[J]. Toxicology Letters, 2011, 205: 183-189.

[16] 管永波, 郝鵬飛, 唐春宇, 等. 氟化鈉對小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞StAR和P450scc mRNA表達(dá)的影響[J]. 衛(wèi)生研究, 2012, 41(1): 105-108.

[17] 王麗蕃. 藏黨參中主要活性成分的測定及其多糖對睪丸間質(zhì)細(xì)胞影響的研究[D]. 北京: 中央民族大學(xué), 2009.