節(jié)節(jié)草多糖的體外抗氧化活性

張俊生，陳莉華*，朱士龍，吳孝濤，肖 斌

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

節(jié)節(jié)草為木賊科多年生草本植物，在《中國(guó)藥典》2010版中學(xué)名為木賊[1]，含黃酮[2]、生物堿[3]、植物多糖及有機(jī)硅等活性成分。節(jié)節(jié)草藥用歷史悠久，已有報(bào)道證實(shí)其具有降血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、降低炎性因子分泌等效應(yīng)[4-6]。天然多糖由于具有抗氧化、防衰老、抗腫瘤、降血糖等生物活性在食品和藥品開(kāi)發(fā)與利用方面已引起廣泛關(guān)注。從常見(jiàn)的植物食品如黃瓜[7]、蘆筍[8]、 野艾蒿[9]提取純化多糖的研究不斷見(jiàn)諸報(bào)道。國(guó)內(nèi)外目前已報(bào)道了200 多種天然多糖[10]，其中95%以上為植物多糖，充分利用植物多糖的天然無(wú)毒性開(kāi)發(fā)各種功能性食品和保健品滿足了人類對(duì)天然產(chǎn)品的渴望。

本實(shí)驗(yàn)以節(jié)節(jié)草為原料，采用超聲波輔助提取多糖，探討節(jié)節(jié)草多糖粗品和多糖純品的體外抗氧化活性，并與VC進(jìn)行對(duì)比，以期為節(jié)節(jié)草資源的合理利用及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

節(jié)節(jié)草采于吉首本地，經(jīng)吉首大學(xué)資環(huán)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定確認(rèn)。動(dòng)物油為市售新鮮豬板油熬制而成，金健牌茶籽油(植物油)購(gòu)于吉首本地超市。

苯酚、沒(méi)食子酸、VC、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、冰醋酸、淀粉、KI、H2SO4、CHCl3、I2等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ250-E型超聲波清洗器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、K-201B-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上?；|試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；723可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海荊和分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 節(jié)節(jié)草多糖的提取純化及含量測(cè)定

稱取一定量節(jié)節(jié)草粉末，按料液比1：10(m/V)加入蒸餾水，在溫度60℃、功率250W條件下超聲波提取40min，提取3次后合并濾液，減壓濃縮，濃縮液加入3倍量95%乙醇，醇沉兩次，將沉淀離心，用乙醚除脂質(zhì)2次，Sevag法除蛋白質(zhì)3次，再次離心收集上清液，即得到節(jié)節(jié)草多糖粗品溶液，將多糖粗品溶液以液料比10：1(V(多糖粗品)：m(樹(shù)脂))過(guò)D-101樹(shù)脂柱，0.2mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，得到節(jié)節(jié)草多糖純品溶液。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[7-9]。以葡萄糖為對(duì)照品，波長(zhǎng)490nm處測(cè)得吸光度(A)與葡萄糖質(zhì)量濃度(ρ)之間的回歸方程為：A=0.0055ρ－0.0053(R2=0.9998)，線性范圍：10～100μg/mL。多糖粗品溶液多糖含量8.42%，多糖純品溶液多糖含量30.57%。

1.3.2 節(jié)節(jié)草多糖提取液清除·OH作用測(cè)定

建立Fenton反應(yīng)體系模型[7-9]。取2mmol/L FeSO4溶液3mL于比色管中，加入1mmol/L H2O2溶液3mL，再加入6mmol/L水楊酸溶液3mL，立即搖勻，37℃水浴下加熱15min后取出，然后加入1.0mL提取液，繼續(xù)水浴加熱15min，以空白液為參比在波長(zhǎng)510nm處測(cè)其吸光度AX。取1.0mL蒸餾水代替提取液按照以上方法進(jìn)行檢測(cè)，37℃水浴恒溫15min后測(cè)得其吸光度A0，重復(fù)3次。以相同質(zhì)量濃度VC溶液作對(duì)比，按式(1)計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率。

式中：A0為空白對(duì)照液吸光度；Ax為待測(cè)樣品液吸光度；Ax0為本底吸光度。

1.3.3 節(jié)節(jié)草多糖提取液清除O2－·作用測(cè)定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的O2－·并生成有色中間產(chǎn)物，可通過(guò)比色法檢測(cè)[7-9]。取pH8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和1.0mL樣品提取液，混勻，室溫條件下放置4min，325nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度(Aj)。再取Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和7mmol/L鄰苯三酚3.0mL，混勻，室溫條件下放置4min，325nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度(A0)。依上法，取Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和1.0mL樣品提取液，混勻后在室溫條件下放置4min，加入3.0mL鄰苯三酚，計(jì)時(shí)，5min后于波長(zhǎng)325nm處測(cè)定體系的吸光度(A)。以相同質(zhì)量濃度VC溶液作對(duì)比，計(jì)算樣品對(duì)O2－·清除率。

式中：A為樣品加入緩沖溶液及鄰苯三酚后的吸光度；Aj為樣品加入緩沖溶液后的吸光度；A0為緩沖溶液加入鄰苯三酚后的吸光度。

1.3.4 節(jié)節(jié)草多糖提取液對(duì)NO2－清除作用的測(cè)定

NO2－在酸性條件下與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生反應(yīng)，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在波長(zhǎng)538nm處有最大吸收，因此，可用分光光度法間接測(cè)定NO2－的量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取10μg/mL亞硝酸鈉溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于50mL容量瓶中，分別加入4g/L的對(duì)氨基苯磺酸溶液2.0mL，混勻，靜置5min，再加入2g/L的鹽酸萘乙二胺溶液1mL，加水至刻度，混勻，靜置15min。在波長(zhǎng)538nm處測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.3969ρ+0.0403(R2=0.9969)，NO2－在0～0.2μg/mL之間有良好的線性關(guān)系。

吸取1mL樣品液，加入10μg/mL的亞硝酸鈉溶液1.0mL，以相同質(zhì)量濃度VC溶液作對(duì)比，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算NO2－量及樣品對(duì)NO2－的清除率。

式中：ρ為未加多糖提取液前由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的NO2－的量/(μg/mL)；ρ0為加入多糖提取液后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的NO2－的量/(μg/mL)。

1.3.5 節(jié)節(jié)草多糖提取液抗油脂氧化實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[1 1]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出碘量-吸光度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。碘量(M，μmol)與吸光度A在0 ～0.96 μmol 間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為M=4.0153A+0.0039(R2=0.9986)。

多糖提取液對(duì)油脂的抗氧化性采用國(guó)際上通用的烘箱強(qiáng)化貯存法：稱取20g油脂，加入2mL提取物，攪拌均勻后，放入烘箱中強(qiáng)化保存，間隔1h交換在烘箱中的位置并取1mL待測(cè)樣品，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法分別測(cè)定波長(zhǎng)585nm處的吸光度。以同質(zhì)量濃度VC溶液作對(duì)比，比較其抗氧化能力。按式(4)計(jì)算油脂過(guò)氧化值(POV)及多糖對(duì)油脂的氧化抑制率(η)。

式中：M表示碘生成量/mmol；m表示油脂質(zhì)量/kg。

式中：POV初為未對(duì)油脂進(jìn)行強(qiáng)化氧化時(shí)的過(guò)氧化值/(mmol/kg)；POV末1為添加多糖的油脂強(qiáng)化氧化后的過(guò)氧化值/(mmol/kg)；POV末2為未添加多糖的油脂強(qiáng)化氧化后的過(guò)氧化值/(mmol/kg)。

取相同質(zhì)量濃度的節(jié)節(jié)草多糖溶液加入到20g植物油和豬油中，充分?jǐn)嚢韬?，分別置于40、50、60℃烘箱內(nèi)，間隔1h取樣檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 節(jié)節(jié)草多糖質(zhì)量濃度對(duì)清除·OH的影響

圖 1 多糖質(zhì)量濃度對(duì)·OH清除率的影響Fig.1 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purifi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against ·OH

由圖1可知，節(jié)節(jié)草多糖粗品、純化品清除·OH的作用均比較明顯；在質(zhì)量濃度0～0.9mg/mL范圍內(nèi)，隨著兩種多糖質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸升高，但均低于VC的清除率；此外，節(jié)節(jié)草粗多糖對(duì)·OH的清除率均較純化多糖高?？傮w而言，對(duì)·OH清除率的大小排序?yàn)椋篤C＞節(jié)節(jié)草多糖粗品＞節(jié)節(jié)草多糖純化品。

2.2 節(jié)節(jié)草多糖質(zhì)量濃度對(duì)清除O2－·的影響

圖 2 多糖質(zhì)量濃度對(duì)O－2·清除率的影響Fig.2 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purif eid polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against O2－·

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)所選取質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兩種節(jié)節(jié)草多糖對(duì)O2－·的清除率具有相同趨勢(shì)，都是隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而升高，節(jié)節(jié)草多糖粗品的清除率略好于多糖純化品，但明顯都較VC的清除率低。

2.3 節(jié)節(jié)草多糖質(zhì)量濃度對(duì)清除NO2－的影響

圖 3 多糖質(zhì)量濃度對(duì)NO2－清除率的影響Fig.3 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purifi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against NO2－

由圖3可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，3種溶液對(duì)NO2－的清除率均呈上升趨勢(shì)，且VC對(duì)NO2－的清除率最高。在質(zhì)量濃度為0.23mg/mL時(shí)，VC對(duì)NO2－的清除率已大于97.5%，質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL后，清除率上升不明顯，基本穩(wěn)定在98%左右。多糖粗品、多糖純化品對(duì)NO2－的清除率也隨質(zhì)量濃度的升高而增大，但在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，多糖粗品清除率均好于多糖純化品。

2.4 節(jié)節(jié)草多糖對(duì)·OH、O－2·及NO2－清除能力比較

由表1、2可知，節(jié)節(jié)草多糖粗品、多糖純化品均對(duì)·OH、O2－·及NO2－有很好的清除作用，相同質(zhì)量濃度下，兩種多糖的清除能力為：NO2－＞O2－·＞·OH，但多糖粗品清除率均高于多糖純化品。

表 1 不同質(zhì)量濃度的多糖粗品對(duì)·OH、O－2·及NO2－的清除率Table 1 Scavenging activity of crude polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. at different concentrations against ·OH, O2－· and NO2－%

表 2 不同質(zhì)量濃度的多糖純化品對(duì)OH、O2- 及NO2- 的清除率Table 2 Scavenging activity of purififi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. at different concentrations against OH, O2-and NO2- %

一般來(lái)說(shuō)，植物多糖的活性與其分子質(zhì)量、溶解度、黏度和化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]。富硒花生中的粗多糖相對(duì)于純化多糖，具有更長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間、更高的DPPH自由基清除能力和更高的還原力[13]，對(duì)蟲(chóng)草與富硒蟲(chóng)草多糖的體外抗氧化活性研究表明，蟲(chóng)草多糖對(duì)O2－·和H2O2的清除能力依次為富硒蟲(chóng)草胞外多糖＞富硒蟲(chóng)草胞內(nèi)多糖＞蟲(chóng)草胞外多糖＞蟲(chóng)草胞內(nèi)多糖，而對(duì)·OH的清除能力依次為：富硒蟲(chóng)草胞外多糖＞蟲(chóng)草胞外多糖＞富硒蟲(chóng)草胞內(nèi)多糖＞蟲(chóng)草胞內(nèi)多糖[14]。多糖的活性還與共存的植物蛋白有關(guān)，對(duì)娑羅子多糖的生物活性研究表明，對(duì)·OH、H2O2和DPPH自由基的清除作用，粗多糖的活性強(qiáng)于去蛋白多糖[15]。本研究結(jié)果也表明，節(jié)節(jié)草中的多糖粗品比去蛋白后的多糖純化品具有更好的清除·OH、O2－·、NO2－的能力。

2.5 多糖對(duì)油脂的抗氧化活性

2.5.1 溫度對(duì)多糖抗油脂氧化效果的影響

由圖4可知，在測(cè)定節(jié)節(jié)草多糖粗品對(duì)植物油氧化抑制率的過(guò)程中，溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響很大。3種溫度條件下，多糖對(duì)植物油氧化抑制率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后又降低。此外，40～50℃時(shí)，隨著溫度的升高，多糖的氧化抑制率也不斷升高，但溫度升高至60℃時(shí)，多糖對(duì)油樣的氧化抑制率反而下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在加熱條件下，引發(fā)了植物油發(fā)生了自氧化反應(yīng)，同時(shí)溫度較高使多糖的熱穩(wěn)定性降低，造成抗氧化劑對(duì)植物油的氧化抑制率降低。

同樣，節(jié)節(jié)草多糖粗品對(duì)動(dòng)物油氧化抑制與對(duì)植物油的抑制效果相似，均是隨著溫度的升高，抑制率先上升后下降，比較圖4a和圖4b可以明顯看出：節(jié)節(jié)草多糖粗品對(duì)植物油的氧化抑制率隨溫度的變化更為明顯，在相同條件下，節(jié)節(jié)草多糖粗品對(duì)植物油氧化抑制效果大于對(duì)動(dòng)物油的氧化抑制效果。

圖 4 溫度對(duì)多糖抑制油脂氧化的影響Fig.4 Infl uence of temperature on anti-lipid oxidation activity of crude polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf.

2.5.2 多糖純化前后對(duì)油脂的抗氧化性比較

分別比較了VC、節(jié)節(jié)草多糖粗品、純化品對(duì)植物油和動(dòng)物油的抗氧化效果。分別在20g植物油和豬油中加入質(zhì)量濃度均為0.5mg/mL的節(jié)節(jié)草多糖粗品溶液、多糖純品溶液及VC溶液2mL，混合均勻后，分別置于40℃烘箱內(nèi)，每隔1h取樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表 3 多糖純化前后對(duì)植物油氧化抑制率比較Table 3 Antioxygen on antioxidation activity of polysaccharide to vegetable oil %

表 4 多糖純化前后對(duì)動(dòng)物油氧化抑制率比較Table 4 Antioxygen on antioxidation activity of polysaccharide to fat%

由表3、4可知，相同質(zhì)量濃度條件下，節(jié)節(jié)草多糖粗品、多糖純化品對(duì)植物油和豬油均有較好的抗氧化效果，對(duì)動(dòng)物油來(lái)說(shuō)，節(jié)節(jié)草多糖粗品抗氧化效果明顯弱于多糖純化品，而對(duì)植物油來(lái)說(shuō)，卻無(wú)顯著差別，但兩者均不及VC的抗氧化作用，在烘箱放置時(shí)間變化很大時(shí)，多糖粗品對(duì)油樣的抑制率變化并不大，而多糖純化品對(duì)油樣的抑制率變化比較大。

3 結(jié) 論

節(jié)節(jié)草多糖粗品及純化品的體外抗氧化結(jié)果表明，二者在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)·OH、O2－·及NO2－均有一定的清除作用，且清除效果與多糖質(zhì)量濃度有劑量效應(yīng)關(guān)系。

在清除·OH、O2－·及NO2－時(shí)，相同質(zhì)量濃度條件下節(jié)節(jié)草多糖純化品的清除效果均弱于同質(zhì)量濃度的多糖粗品，這是因?yàn)橹参锒嗵堑幕钚耘c其不僅與其分子質(zhì)量、溶解度、黏度和化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與共存的植物蛋白也有關(guān)系，在清除自由基方面，含植物蛋白的粗多糖往往比純化多糖效果更好。

節(jié)節(jié)草多糖粗品及純化品對(duì)植物油及動(dòng)物油均有一定的抗氧化效果，總體而言，多糖粗品對(duì)植物油氧化抑制率大于對(duì)動(dòng)物油氧化抑制率，但受溫度、時(shí)間的影響變化較大。

節(jié)節(jié)草多糖具有良好的抗氧化能力，原料來(lái)源廣，提取工藝簡(jiǎn)單，作為一種新的天然、保健的綠色食品抗氧化劑應(yīng)有良好的開(kāi)發(fā)前景。

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