蓮房原花青素對大強度運動小鼠器官與組織的保護(hù)作用

吳 俊，姚 平，高 超

(1.中國人民解放軍軍事經(jīng)濟(jì)學(xué)院營養(yǎng)食品研究所，湖北 武漢 430035；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與衛(wèi)生學(xué)系，湖北 武漢 430030)

原花青素(proanthocyanidins，PC)屬于植物來源的聚多酚類化合物，是由兒茶素、表兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯通過C4—C6或 C4—C8縮合而成的不同聚合度的混合物，廣泛存在于葡萄、山楂、蘋果、草莓、藍(lán)莓、紫薯、可可豆、油菜籽、蓮等多種植物中，為植物的次生代謝產(chǎn)物[1-3]。國內(nèi)外大量研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抗皮膚過敏、擴張血管、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心血管疾病等多項生理功能，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域的研究價值日益受到關(guān)注。目前，對原花青素的開發(fā)已擴展到多個植物品種，其中包括蓮科藥用植物——蓮。蓮在我國是一種分布非常廣泛的天然植物資源，具有很高的食用與藥用價值。近年來的研究顯示，蓮的成熟花托(蓮房)中含有豐富的蓮房原花青素(lotus seedpod proanthocyanidins，LSPC)，其分子聚合度低，生物利用率高，在清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抑制心血管疾病等方面均表現(xiàn)出顯著的生理活性[4-6]。基于此，本研究采取乙醇浸提，柱層析純化法提取蓮房原花青素，建立小鼠大強度運動訓(xùn)練模型，通過灌服不同劑量蓮房原花青素，測試與分析小鼠在大強度力竭性運動條件下的生理生化指標(biāo)和組織器官變化，探討蓮房原花青素對大強度運動訓(xùn)練動物機體的保護(hù)作用，為拓展蓮房原花青素在軍事體能訓(xùn)練與體育競技運動保健食品方面的應(yīng)用研究提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇產(chǎn)自湖北省洪湖地區(qū)當(dāng)年生新鮮去籽蓮房，清水洗滌后經(jīng)石油醚脫脂，低溫干燥、粉碎，加入一定量體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，于60℃條件下振蕩、浸提90min，減壓蒸餾去除浸提液中的乙醇，過濾，將濾液經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離純化后冷凍干燥，得淺黃色蓮房原花青素提取物[6-8]。以兒茶素為對照品，采用硫酸-香草醛法[9]測定提取物中原花青素含量大于98%，計算得率為3.06%。

BALB/c ICRC57清潔級雄性成年小鼠，體質(zhì)量(18±1)g 上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；乳酸(LA)、肝糖原、肌糖原試劑盒 深圳麥瑞生物醫(yī)療電子有限公司；石油醚、乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2全能酶聯(lián)儀 美國Molecular Devices公司；BS-200全自動生化分析儀 美國貝克曼庫爾特公司；Hemastar 3血球計數(shù)儀 法國Yoder公司。

1.3 方法

將BALB/c ICRC57清潔級雄性成年小鼠，隨機分為5組，每組10只。具體分組如下：A.安靜對照組；B.運動對照組；C. LSPC低劑量運動組(20mg/(kg·d))；D. LSPC中劑量運動組(50mg/(kg·d))；E. LSPC高劑量運動組(100mg/(kg·d))。

各組小鼠經(jīng)口灌胃給予不同劑量的蓮房原花青素或?qū)φ瘴?蒸餾水)，連續(xù)30d。在灌胃的第20天起，各運動組小鼠先進(jìn)行3d的適應(yīng)性跑臺運動，休息2d后，開始正式大強度力竭性運動。每次運動初始速率為10m/min，在10min內(nèi)逐漸增加負(fù)荷達(dá)到28m/min速率，以弱電刺激小鼠持續(xù)跑動60min，每天1次，至第5天運動結(jié)束，立即處死各運動組小鼠，采血，解剖分離心、肝、腎和股四頭肌，作生化檢測與病理分析[10-12]。

1.4 指標(biāo)測定

血液學(xué)指標(biāo)：采血，EDTAK2抗凝后利用全自動生化分析儀測定血紅蛋白(Hb)，利用血球計數(shù)儀計數(shù)紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)及其分類(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)。

BUN、Cre、GPT、GOT、LDH、CK活力：采用酶動力學(xué)法測定；BUN、Cre含量：采用兩點法測定；肝糖原、肌糖原、LA水平：采用酶法測定；SOD水平：采用黃嘌呤氧化酶法測定；GSH水平：采用二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)比色法測定；MDA水平：采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定。上述指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明程序進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行方差分析與Q檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 LSPC對大強度運動小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

表 1 LSPC對大強度運動小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of LSPC on blood indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

表 1 LSPC對大強度運動小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of LSPC on blood indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

注：*.與A 組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)；**.與A 組相比，有極顯著性差異(P ＜0.01)；Δ.與B 組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)；ΔΔ.與B 組相比，有極顯著性差異(P ＜0.01)。下同。

WBC分類/(109/L)淋巴 單核A2.18±0.26115.8±9.43.02±0.452.95±0.390.07±0.08 B1.67±0.19**79.5±6.3**5.87±1.22**5.66±1.09**0.21±0.18 C2.05±0.32Δ83.7±7.5**4.59±1.02**Δ 4.43±0.95**Δ0.16±0.15 D1.82±0.20** 94.6±10.2**ΔΔ 4.23±1.17*ΔΔ 4.07±1.01*ΔΔ0.16±0.18 E2.18±0.27ΔΔ89.7±8.1**Δ4.90±0.85**4.71±0.94**0.18±0.08組別RBC/(1012/L)Hb/(g/L)WBC/(109/L)

大強度運動條件下機體活性自由基生成量增多，攻擊細(xì)胞器及亞細(xì)胞器，成為造成機體組織出現(xiàn)運動性炎癥反應(yīng)的重要原因，甚至引發(fā)一系列病理損傷[13-14]。由表1可見，經(jīng)過大強度力竭性運動，與A組小鼠相比，B組小鼠的RBC與Hb水平極顯著下降，WBC與淋巴細(xì)胞計數(shù)極顯著升高，說明大強度運動訓(xùn)練已致小鼠免疫功能下降，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。當(dāng)預(yù)先給予不同劑量的蓮房原花青素后，小鼠的上述指標(biāo)均有不同程度的恢復(fù)，且中等劑量組干預(yù)效果明顯，這主要與蓮房原花青素具有較強的清除自由基活性直接相關(guān)。

2.2 LSPC對大強度運動小鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表2可見，B組小鼠的血清GPT、GOT明顯升高，反映大強度力竭性運動后小鼠肝細(xì)胞受到損傷；BUN、Cre水平的升高則提示腎臟受到不良影響；過度運動導(dǎo)致骨骼肌中的CK和臟器細(xì)胞胞漿中的LDH大量滲出，從而使血清中CK與LDH水平極顯著升高，提示臟器及骨骼肌受損；血糖是機體能量的重要來源，大強度力竭性運動條件下小鼠出現(xiàn)能量代謝障礙，細(xì)胞無氧代謝強度增加，致使血糖水平下降，而血液中LA水平明顯增高，將加速運動性疲勞產(chǎn)生。經(jīng)不同劑量的蓮房原花青素干預(yù)后，小鼠上述血清指標(biāo)均有不同程度的改善，尤其以中、高劑量組干預(yù)效果顯著。

表 2 LSPC對大強度運動小鼠血清生化指標(biāo)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of LSPC on serum biochemical indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

表 2 LSPC對大強度運動小鼠血清生化指標(biāo)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of LSPC on serum biochemical indexes in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

組別 GPT活力/(U/L) GOT活力/(U/L) BUN含量/(mmol/L) Cre含量/(μmol/L) Glu含量/(mmol/L) LA含量/(mmol/L) LDH活力/(1000U/L) CK活力/(U/L)A47.2±5.4113±154.48±0.6038.9±5.15.53±0.664.22±0.581.83±0.31354±41 B63.1±7.6**179±21**7.89±1.01**47.6±6.3**3.11±0.37**6.38±1.03**3.09±0.51**822±114**C59.7±7.6**144±19**ΔΔ6.92±1.35**44.8±5.7*3.44±0.50**6.00±0.92**2.88±0.46**772±98**D51.7±8.9ΔΔ149±22**ΔΔ5.83±0.72**ΔΔ38.4±7.0Δ3.95±0.54**ΔΔ5.87±0.70**2.24±0.50ΔΔ686±83**Δ E54.8±6.3*Δ156±27**6.07±0.85**ΔΔ41.6±8.93.38±0.54**5.75±0.88**2.49±0.43**Δ759±95**

2.3 LSPC對大強度運動小鼠肌肉及臟器的影響

解剖各組小鼠，取股四頭肌、心肌、肝臟、腎臟，勻漿后測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量，測定肝糖原和肌糖原的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表3所示。

表 3 LSPC對大強度運動小鼠臟器氧化應(yīng)激保護(hù)作用及肝、肌糖原水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of LSPC on the protection of oxidative stress-induced organ damage, and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

表 3 LSPC對大強度運動小鼠臟器氧化應(yīng)激保護(hù)作用及肝、肌糖原水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of LSPC on the protection of oxidative stress-induced organ damage, and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice with high intensity exercise(±s，n=10)

注：—. 該項指標(biāo)未進(jìn)行測定。

組織 組別SOD活力/(U/mg pro)GSH含量/(nmol/mg pro)MDA含量/(nmol/mg pro)糖原含量/%股四頭肌A13.8±1.51.67±0.254.87±0.531.26±0.19 B9.4±1.1**1.15±0.12**7.95±1.05**0.68±0.16**C10.9±1.1**Δ1.37±0.21*Δ6.32±0.90**ΔΔ0.78±0.19**D11.5±1.4**ΔΔ 1.42±0.18*ΔΔ6.09±1.04**ΔΔ0.90±0.16**Δ E11.7±1.0**ΔΔ 1.59±0.24ΔΔ7.13±1.29**0.74±0.21**心肌A31.8±2.92.51±0.244.58±0.62—B22.4±2.6**1.73±0.19**8.71±0.99**—C25.6±1.9**Δ2.16±0.25*ΔΔ6.14±0.82**ΔΔ —D24.3±2.8**2.25±0.21*ΔΔ6.02±0.65**ΔΔ —E25.7±2.5**Δ1.84±0.27**7.87±1.28**—肝臟A43.8±3.72.81±0.237.36±0.911.91±0.28 B31.9±4.5**1.90±0.20**11.88±1.67**1.09±0.17**C32.7±3.8**2.26±0.25**ΔΔ10.25±1.82**1.26±0.24**D38.4±5.1**Δ2.39±0.31**ΔΔ9.38±1.36**ΔΔ1.38±0.24**Δ E34.3±4.7**2.08±0.26**9.94±1.49**Δ1.26±0.27**A27.6±2.41.95±0.235.88±0.81—B19.0±2.0**1.16±0.24**9.03±1.22**—C23.8±1.6**ΔΔ 1.34±0.17**8.09±0.97**—D26.9±3.0ΔΔ1.78±0.22ΔΔ7.47±0.91**ΔΔ —E24.8±2.5*ΔΔ 1.49±0.30**Δ8.36±0.67**—腎臟

肝臟與腎臟通常是大強度運動訓(xùn)練過程中臟器損傷的主要靶器官，心肌組織與骨骼肌也是過度運動的易損部位[14-15]。由表3可見，在大強度力竭性運動的強氧化應(yīng)激作用下，小鼠機體抗自由基損傷能力受到干擾，大量自由基持續(xù)攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致小鼠股四頭肌、心肌、肝臟、腎臟中SOD活力顯著下降，MDA水平明顯升高。同時，GSH與肝糖原大量消耗，提示大強度力竭性運動導(dǎo)致機體免疫功能及能量代謝過程受到影響。給予不同劑量的蓮房原花青素，上述各指標(biāo)均有不同程度的恢復(fù)，尤其以中劑量干預(yù)效果明顯，說明蓮房原花青素對大強度力竭性運動引起的臟器組織氧化應(yīng)激具有明顯的保護(hù)作用，并可在一定程度上維持肝糖原和肌糖原的正常水平，從而有效降低過度運動所致的疲勞損傷，提高運動訓(xùn)練效果。

2.4 LSPC對大強度運動小鼠骨骼肌與心肌病理變化的影響

圖 1 各組實驗小鼠骨骼肌切片F(xiàn)ig.1 Skeletal muscle sections of the mice from each group

圖 2 各組實驗小鼠心肌切片F(xiàn)ig.2 Cardiac muscle sections of the mice from each group

由圖1可知，運動對照組小鼠的骨骼肌纖維呈現(xiàn)廣泛腫脹，形態(tài)扭曲或斷裂，有肌溶解現(xiàn)象，肌核分布不勻，甚至局部出現(xiàn)核聚集[16]。而給予蓮房原花青素的運動組小鼠，其骨骼肌仍保持了較為規(guī)則的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只呈現(xiàn)出輕微腫脹。由圖2可知，運動對照組小鼠心肌纖維廣泛扭曲、斷裂，出現(xiàn)肌溶解與間質(zhì)出血，心肌灶性壞死，而灌服蓮房原花青素的運動組小鼠，其心肌纖維雖然存在局部扭曲或斷裂，但與運動對照組相比，肌纖維排列較規(guī)則，異常表現(xiàn)輕微。圖1、2表明，蓮房原花青素對大強度運動訓(xùn)練條件下小鼠的骨骼肌與心肌具有一定的保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

利用蓮房原花青素在清除自由基以及抗脂質(zhì)過氧化方面所表現(xiàn)出的生理活性，能夠有效緩解大強度力竭性運動訓(xùn)練對小鼠臟器及組織細(xì)胞的不良影響，并通過降低毛細(xì)血管通透性，減少毛細(xì)血管壁的脆性，以減輕大強度運動所致的機體炎癥反應(yīng)；蓮房原花青能夠促進(jìn)無氧代謝條件下血乳酸的清除，降低大強度運動訓(xùn)練導(dǎo)致的強氧化應(yīng)激損傷，對骨骼肌、心臟、肝臟及腎臟均表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，并呈現(xiàn)出一定的劑量性依賴關(guān)系。綜上所述，蓮房原花青素在緩解大強度運動性疲勞，預(yù)防過度訓(xùn)練所致機體損傷等方面具有明顯的生理功能性作用。

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