不同熱處理對(duì)沙門(mén)氏菌DNA消亡的影響

劉 杰，李苗云*，趙改名，柳艷霞，高曉平，田 瑋，黃現(xiàn)青，張秋會(huì)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

沙門(mén)氏菌廣泛分布于自然界，是腸桿菌科中一種常見(jiàn)、重要的人畜共患病原菌之一，對(duì)人類和動(dòng)物具有極大危害，沙門(mén)氏菌污染能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、腸胃炎和食物中毒等病癥[1-3]。其中肉、蛋、乳等營(yíng)養(yǎng)豐富的食品是沙門(mén)氏菌的主要傳播介質(zhì)，直接影響著人們的飲食健康安全[4-5]。近年來(lái)，核酸分析被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)，具有檢測(cè)范圍廣、敏感度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，大大提高了檢測(cè)的效率，縮短了檢測(cè)流程，但其存在假陽(yáng)性偏高等問(wèn)題[5-9]。魯玉俠等[10]研究了121℃、15min 處理后沙門(mén)氏菌的PCR擴(kuò)增效果，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物電泳條帶很明顯。Malorny[11]、Nocker[12]、Oliveira[13]等研究指出死菌DNA會(huì)長(zhǎng)期存在。另外，很多研究者[14-18]指出死菌DNA的存在使基因水平的檢測(cè)方法高估了樣品中活菌的水平。而我國(guó)肉類食品有低溫、高溫、涮、煎、烤等多種加工和消費(fèi)方式，常用的熱處理方式對(duì)沙門(mén)氏菌致死情況和DNA的破壞程度不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M肉品在加工和消費(fèi)過(guò)程中常用的幾種加熱處理過(guò)程，以研究不同熱處理對(duì)沙門(mén)氏菌致死效果以及對(duì)沙門(mén)氏菌DNA消亡的影響，為肉品消費(fèi)時(shí)的安全性和沙門(mén)氏菌檢測(cè)技術(shù)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ASI.1859F3) 雙匯集團(tuán)技術(shù)中心提供。

U N I Q-1 0 柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司；2×PCR Solution Premix PrimeSTAR?HS 寶生物工程大連有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HIRAYAMA高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；HH-501恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；DYY-12型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

取沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ASI.1859F3接種到5mL液體LB培養(yǎng)基中。37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)14～16h，使菌液達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。平板計(jì)數(shù)得到初始菌濃。

1.3.2 不同熱處理對(duì)沙門(mén)氏菌存活狀況的影響

模擬肉品在加工和消費(fèi)過(guò)程中常用的熱處理過(guò)程，取1mL過(guò)夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌液加入到1.5mL PE管中，分別按照65℃保溫20min、85℃保溫30min、沸水浴2min、沸水浴3min、121℃保溫15min進(jìn)行加熱處理。處理后的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每種處理3個(gè)平行。

1.3.3 基因組DNA的提取

取菌液1mL，10000r/min離心1min，棄上清收集菌體，UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提基因組DNA，制備的DNA樣品溶解于50μL TE緩沖液中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熱處理后沙門(mén)氏菌不同放置時(shí)間對(duì)基因組DNA消亡的影響

對(duì)不同熱處理后完全失活的組別進(jìn)行室溫放置，每隔1d取菌液1mL提取基因組DNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳120V，25min，EB染色后紫外分析儀進(jìn)行分析。

1.3.5 熱致死后沙門(mén)氏菌殘存DNA的PCR擴(kuò)增

致死后的菌液經(jīng)過(guò)一段時(shí)間放置后按1.3.3節(jié)方法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)已發(fā)表的鼠傷寒沙門(mén)氏菌特異性inva基因核苷酸序列(GenBank AE008832)設(shè)計(jì)，上游引物(5’-GTG AAA TAA TCG CCA CGT CGG GCA A-3’)；下游引物(5’-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3’)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為285bp[19]。引物由寶生物工程大連有限公司合成。采用20μL反應(yīng)體系：2×PCR Solution Premix PrimeSTAR?HS 10μL、1μmol/L Forward Primer 2μL、1μmol/L Reverse Primer 2μL、DNA模板 2μL、dH2O(滅菌蒸餾水)4μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃、30s；95℃、5s；64℃、34s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2min。取3μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并進(jìn)行紫外光譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加熱處理后對(duì)沙門(mén)氏菌存活狀況的影響

表 1 不同加熱處理對(duì)沙門(mén)氏菌的致死情況Table 1 The death status of Salmonella under different heat treatments

從表1可知，所采取的5種熱處理方式均能有效殺死菌液中的沙門(mén)氏菌，其中65℃ 20min、85℃ 30min、沸水浴3min、121℃ 15min處理能完全殺死菌液中沙門(mén)氏菌，沸水浴2min處理后雖不能完全殺死菌液中的沙門(mén)氏菌，但其菌落形態(tài)已發(fā)生明顯變化，處理前菌落邊緣光滑，呈乳白色圓形菌落，處理后則菌落較小，顏色暗淡，邊緣呈不規(guī)則齒狀或放射狀的怪異形態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)緩慢。肉品在食用過(guò)程中經(jīng)常會(huì)在沸水中短時(shí)間處理，如火鍋中常見(jiàn)的“涮”，通常時(shí)間較短，對(duì)于沙門(mén)氏菌沸水中處理2min尚不能將其殺死，需要至少3min以上。因此，在肉品消費(fèi)過(guò)程中，需要提高殺菌時(shí)間以提高其安全性。

2.2 致死后沙門(mén)氏菌不同放置時(shí)間對(duì)基因組DNA消亡的影響

經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，65℃ 20min、85℃ 30min、沸水浴3min、121℃ 15min處理后的沙門(mén)氏菌完全失活。對(duì)以上4種方式處理的菌液進(jìn)行室溫放置，每隔1d提取細(xì)菌基因組DNA，電泳后進(jìn)行分析。

2.2.1 65℃、20min處理后電泳結(jié)果

圖 1 65℃、20min處理后沙門(mén)氏菌DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis results of the DNA from Salmonella subjected to heat treatment at 65 ℃ for 20 min

由圖1可知，與原菌液相比，65℃、20min處理后的菌液DNA的條帶亮度明顯變?nèi)酰阅芸闯銮逦臈l帶。說(shuō)明65℃、20min處理會(huì)破壞部分基因組DNA，影響DNA的提取效果，但不能完全使其降解。隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA條帶慢慢變?nèi)?，說(shuō)明致死后的細(xì)菌DNA會(huì)逐漸降解，但到18d為止，變化并不是很明顯。

2.2.2 85℃、30min處理后電泳結(jié)果

圖 2 85℃、30min處理后沙門(mén)氏菌DNA電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis results of the DNA from Salmonella subjected to heat treatment at 85 ℃ for 30 min

由圖2可知，與原菌液相比，85℃、30min處理后的菌液DNA的條帶亮度明顯變?nèi)?。說(shuō)明85℃、30min處理會(huì)破壞部分基因組DNA，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA條帶逐漸模糊，與65℃、20min處理相比變化更為明顯，說(shuō)明85℃、30min致死后的細(xì)菌DNA降解速度更快，到18d為止，條帶已經(jīng)很模糊，但仍有完整的基因組DNA存在。

2.2.3 沸水浴3min處理后電泳結(jié)果

圖 3 沸水浴3min處理后沙門(mén)氏菌DNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis results of the DNA from Salmonella subjected to boiling for 3 min

由圖3可知，沸水浴3min處理后的菌液在放置1、2、4d后可以看到很微弱DNA的條帶，放置6d后條帶消失。這說(shuō)明沸水浴3min處理對(duì)基因組DNA的破壞程度很大，且對(duì)DNA提取效果的影響很大。隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA降解速度很快，到第6天時(shí)基因組DNA已經(jīng)大部分降解，無(wú)可見(jiàn)條帶。

2.2.4 121℃、15min處理后電泳結(jié)果

由圖4可知，菌液經(jīng)過(guò)121℃、15min處理后，基因組DNA條帶完全消失。說(shuō)明121℃、15min處理會(huì)嚴(yán)重破壞基因組DNA，處理后已經(jīng)沒(méi)有完整的基因組DNA存在。

圖 4 121℃、15min處理后沙門(mén)氏菌DNA電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis results of the DNA from Salmonella subjected to sterilization at 121 ℃ for 15 min

2.2.5 長(zhǎng)時(shí)間放置后死菌殘存DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖 5 長(zhǎng)時(shí)間放置后死菌殘存DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplifi cation of DNA in dead bacilli after long storage period

由圖5可知，沙門(mén)氏菌在經(jīng)過(guò)65℃ 20min、85℃ 30min、沸水浴3min、121℃ 15min處理致死并放置相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間后，其DNA擴(kuò)增條帶依然很明顯。沸水浴3min和121℃、15min處理后DNA的擴(kuò)增條帶比65℃、20min和85℃、30min處理后的有些暗淡。這說(shuō)明雖然DNA電泳條帶已經(jīng)很模糊或消失，但死亡的細(xì)胞中仍存在有大量的目的基因片段存在，且這些基因片段消亡速度很慢，會(huì)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生極大的作用。高溫處理對(duì)DNA的破壞則更為明顯。

由圖1～5可知，經(jīng)過(guò)不同溫度處理后，完整的基因組DNA會(huì)發(fā)生不同程度的降解，在經(jīng)過(guò)沸水浴3min和121℃、15min處理后的細(xì)胞中已經(jīng)很少有完整的大分子質(zhì)量的DNA存在，而是降解為了各種不同大小的基因碎片。沙門(mén)氏菌受到較低溫度處理時(shí)，其基因組DNA的完整性受到的破壞程度相對(duì)較小，但DNA會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也逐漸降解為分子質(zhì)量較小的片段。這些片段就包括引起PCR特異性擴(kuò)增的目的基因片段。這些分子質(zhì)量相對(duì)較小的片段會(huì)長(zhǎng)期存在于死細(xì)胞中并且很不容易消亡，從而對(duì)基于DNA技術(shù)進(jìn)行的病原菌檢測(cè)等產(chǎn)生干擾作用。沙門(mén)氏菌DNA消亡速度與溫度高低和處理的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，加熱溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，沙門(mén)氏菌DNA消亡速度越快。

沙門(mén)氏菌是鮮肉及其制品中常見(jiàn)的，也是我國(guó)對(duì)肉品主要檢測(cè)和控制的食源性病原菌之一。肉類食品有多種加工和消費(fèi)方式，如“涮”、“煎”等，通常時(shí)間較短，本實(shí)驗(yàn)研究表明，對(duì)于沙門(mén)氏菌沸水中處理2min尚不能將其殺死，所以，需要提高殺菌時(shí)間以提高其安全性。而目前，PCR等分子技術(shù)在病原菌檢測(cè)方面的應(yīng)用越來(lái)越多，但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，各種加工肉制品在經(jīng)過(guò)不同溫度殺菌以后，雖然肉品中的細(xì)菌被滅活，但加熱處理并不能使細(xì)菌基因組DNA完全降解消亡，大量的基因片段仍然殘存在死亡的細(xì)胞當(dāng)中，而且消亡速度很慢，尤其在較低溫度處理的肉品中更為明顯，這與死菌DNA會(huì)長(zhǎng)期存在的研究結(jié)果一致[11-13]。121℃、15min處理后沙門(mén)氏菌的PCR研究結(jié)果與魯玉俠等[10]一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加熱溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，沙門(mén)氏菌DNA消亡速度越快，這對(duì)于經(jīng)過(guò)不同加工方式處理后的產(chǎn)品，如果應(yīng)用PCR等技術(shù)分析檢測(cè)沙門(mén)氏菌，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生很大的干擾作用，直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié) 論

肉品在沸水中加熱時(shí)至少在3min以上才能使沙門(mén)氏菌完全滅活；加熱溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，沙門(mén)氏菌DNA消亡速度越快；不同溫度加熱后，菌液中仍存在大量的目的基因片段，對(duì)應(yīng)用DNA分析檢測(cè)沙門(mén)氏菌會(huì)產(chǎn)生很大的干擾作用，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1] TIRADO C, SCHMIDT K. WHO surveillance programme for control of foodborne infections and intoxications, results and trends across greater Europe[J]. Journal of Infection, 2001, 43： 80-84.

[2] WALLACE D J, GILDER T V, SHALLOW S, at al. Incidence of foodborne illnesses reported by the foodborne diseases active surveillance network (foodnet)-1997. foodnetworking group[J]. Journal of Food Protection, 2000, 63： 807-809.

[3] MALORNY B, HOORFAR J, BUNGE C, et al. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR： towards an international standard[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69： 290-296.

[4] ZHANG H M, SHI L, GUO S Y, et al. Identification and characterization of class 1 integron resistance gene cassettes among Salmonella strains isolated fromhealthy humans in China[J]. Microbiology and Immunology, 2004, 48(9)： 639-645.

[5] MALORNY B, BUNGE C, HELMUTH R. A real-time PCR for the detection of Salmonella enteritidis in poultry meat and consumption eggs[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 70(2)： 245-251.

[6] MINAM H, SRINIVASAN V, GILLESPIE B E, et al. Application of SYBR green real-time PCR assay for specific detection of Salmonella spp. in dairy farm environmental samples[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005, 102： 161-171.

[7] KNUT R, BIRGITTEM, SIGNEM D, et al. Use of ethidiummonoazide and PCR in combination for quantification of viable and dead cells in complex samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(2)： 1018-1024.

[8] PUSTERLA N, BYRNE B A, HODZIC E, et al. Use of quantitative real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in fecal samples from horses at a veterinary teaching hospital[J]. The Veterinary Journal, 2010, 186： 252-255.

[9] PERELLE S, DILASSER F, MALORNY B, et al. Comparison of PCR-ELISA and lightcycler real-time PCR assays for detecting Salmonella spp. in milk and meat samples[J]. Molecular and Cellular Probes, 2004, 18： 409-420.

[10] 魯玉俠, 郭祀遠(yuǎn), 石磊. EMA-LAMP方法快速檢測(cè)死/活的食源性沙門(mén)氏菌[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(22)： 324-327.

[11] MALORNY B, TASSIOS P T, COOK N, et al. Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens[J]. Food Microbiol, 2003, 83(1)： 39-48.

[12] NOCKER A, CHEUNG C Y, CAMPER A K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells[J]. Journal of Microbiological Methods, 2006, 67： 310-320.

[13] OLIVEIRA S D, SANTOS L R, SCHUCH D M T, et al. Detection and identification of Salmonella from poultry-related samples by PCR[J]. Veterinary Microbiology, 2002, 87： 25-35.

[14] SEO K H, VALENTIN-BON I E, BRACKETT R E. Detection and enumeration of Salmonella enteritidis in homemade ice creamassociated with outbreak： comparison of conventional and real-time PCR methods[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69(3)： 639-643.

[15] WOLFFS P, NORLING B, RADSTRFM P. Risk assessment of falsepositive quantitative real-time PCR results in food, due to detection of DNA originating from dead cells[J]. Journal of Microbiological Methods, 2005, 60： 315-323.

[16] NOGVA H, DROMTORP S, NISSEN H, et al. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5V-nuclease PCR[J]. BioTechniques, 2003, 34(4)： 804-813.

[17] WHYTE P, GILL K M, COLLINS J, et al. The prevalence and PCR detection of Salmonella contamination in raw poultry[J]. Veterinary Microbiology, 2002, 89： 53-60.

[18] LUO Jianfei, LIN Weitie, GUO Yong. Method to detect only viable cells in microbial ecology[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86： 377-384.

[19] MALORNY B, HOORFAR J, BUNGE C, et al. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR： towards an international standard[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69： 290-296.