氟尿嘧啶Gemini表面活性劑囊泡的制備及其體外釋放研究

魏 軍 張春燕 姚慶強

(1．濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東濟南 250012;2．濟寧醫(yī)學院藥學院，山東濟寧 272000;3．山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，山東濟南 250012)

非離子表面活性劑囊泡(niosome，以下簡稱囊泡)結(jié)構(gòu)組成與脂質(zhì)體相似［1］，既可以用來包裹親水性藥物，又可以用來包裹親脂性藥物，且化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，因此在藥物輸送領(lǐng)域，囊泡成為近幾年國內(nèi)外研究的熱點［2－10］。但總體來說，囊泡對水溶性藥物的包封率偏低［4－10］，因此如何提高非離子表面活性劑囊泡對水溶性藥物的包封率一直受到人們的極大關(guān)注［11－13］。Gemini表面活性劑具有兩個親水基和兩個疏水基，具有較高的表面活性和生物安全性，在一定條件下可形成囊泡［14］，且與傳統(tǒng)表面活性劑表現(xiàn)出很好的協(xié)同效應(yīng)。由于雙子表面活性劑的特殊結(jié)構(gòu)，且形成的囊泡具有較脂質(zhì)體更高的穩(wěn)定性，因此該類表面活性劑在醫(yī)藥領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景，然而關(guān)于Gemini表面活性劑囊泡載藥體系的透皮吸收的相關(guān)研究還少見報道。本研究利用非離子Gemini表面活性劑為囊材，以親水性藥物氟尿嘧啶為模型藥物，考察Gemini表面活性劑囊泡對水溶性藥物氟尿嘧啶的包封作用及其體外釋放行為的影響，旨在開發(fā)新型囊材，得到對水溶性藥物包封率高且穩(wěn)定存在的囊泡體系，為藥物的傳輸及緩釋提供依據(jù)。

1 實驗部分

1．1 儀器

760CRT紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);pH酸度計(上?？祪x儀器有限公pHS-3C);78HW-1型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);ZRS-8G智能溶出試驗儀(天津大學無線電廠);Zetasizer3000HS激光粒度分析儀(英國Malvern公司)。

1．2 試劑

氟尿嘧啶原料藥(北京亞希爾化工科技有限公司);氟尿嘧啶化學對照品(中國藥品生物制品鑒定所);Span 60(天津市天大化工實驗廠);膽固醇AR(浙江昌海生物有限公司);三氯甲烷AR(江蘇南京中山集團公司化工廠);甲醇分析純(天津市永大化學試劑有限公司);磷酸氫二鈉AR(天津市瑞金特化學品有限公司);磷酸二氫鈉AR(天津市天河化學試劑廠);磷酸二氫鉀AR(天津市天河化學試劑廠);氫氧化鈉AR(天津市天河化學試劑廠)。

1．3 實驗動物

健康家兔2只，雌雄不限，由濟寧醫(yī)學院動物房提供。

2 實驗方法

2．1 氟尿嘧啶標準曲線的繪制

2．1．1 氟尿嘧啶的紫外光譜圖 準確稱取氟尿嘧啶標準品0．01 g，用pH 5．0的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至10 ml，得濃度為1．0㎎/ml的氟尿嘧啶溶液，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計進行光譜掃描，結(jié)果見圖1。由光譜掃描曲線可知，氟尿嘧啶在266 nm處有最大吸收，空白溶液在這一波長處無影響吸收，因此選定266 nm為檢測波長。

圖1 氟尿嘧啶的光譜掃描圖

2．1．2 氟尿嘧啶的標準曲線的繪制 稱量12．5 mg氟尿嘧啶標準品，用磷酸鹽緩沖液(pH 5．0，20 mmol/L)溶解，并用25 ml棕色容量瓶定容，得1．0 mg/ml氟尿嘧啶溶液。用1 ml刻度移液管分別量取 0．1，0．2，0．3，0．4 ml于 10 ml棕色容量瓶中定容至刻度，過濾后于226 nm波長處，測定其紫外吸收，得吸光度數(shù)據(jù)。由吸光度對濃度做圖，見圖2。

圖2 氟尿嘧啶的標準曲線

由圖2可見，在0～20 μg/ml范圍內(nèi)，氟尿嘧啶吸光度與濃度間存在良好的線性關(guān)系，其標準曲線方程為:Y=0．0550X+0．0014(R2=0．9998)。

2．2 囊泡的制備

2．2．1 囊泡處方 水相:磷酸鹽緩沖液(pH 6．86，5 mmol/L)溶解氟尿嘧啶得氟尿嘧啶溶液。油相:氯仿∶甲醇=2∶1混合溶劑20 ml溶解Span60、Gemini表面活性劑、膽固醇。

2．2．2 空白囊泡的制備 表面活性劑與膽固醇溶于20 ml油相后，于60℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，緩慢抽真空，蒸干后再真空抽10 min左右。抽真空后成的膜以均勻透明為佳。加入20 ml PBS緩沖液，于60℃水浴中水化1 h。隨后常溫水浴超聲5 min。(超聲功率400 W，間隔 3 s，工作3 s。)

2．2．3 氟尿嘧啶載藥囊泡的制備 取氧氟尿嘧啶用PBS溶解，配制不同濃度藥物溶液，表面活性劑與膽固醇溶于20 ml油相后，于60℃水浴中成膜后，加入20 ml藥物溶液，于60℃水浴中水化1 h。隨后常溫水浴超聲5 min。(超聲功率400 W，間隔3 s，工作 3 s。)

2．3 囊泡粒徑及ξ電位測定

將囊泡混懸液放入ZS 90型馬爾文 zetasizer Nano樣品池中，于25℃條件下以光散射法檢測粒徑、粒度分布、均一度，測試角度為90度。將囊泡混懸液裝入U型樣品池中于相同溫度下檢測ξ電位。

2．4 穩(wěn)定性實驗

將制成的OFLO囊泡混懸液分成幾份貯存在冰箱上層(4℃)，分別于制得囊泡后(記為第1天)、3天、7天后取樣檢測其包封率。

2．5 包封率測定

采用透析法檢測囊泡對5-FU的包封率。透析前將醋酸纖維膜(分子量10000～14000)浸泡在PBS中1 h(確保整個膜的完全潤濕)。取1 ml制得的5-FU囊泡混懸液放進透析袋內(nèi)，然后將透析袋轉(zhuǎn)移到25 ml PBS中。接收液中用磁粒子(轉(zhuǎn)速約150 r/min)攪拌。分別于 0．5，1．0，1．5，2．0，2.5，3．0，3．5，4 h 取透析液測定游離藥物吸光度，計算得到藥物的累積釋放率。結(jié)果表明在攪拌2 h時，釋放曲線出現(xiàn)平臺，說明游離藥物擴散基本達到平衡，選取攪拌時間為2 h進行囊泡樣品的透析。

于第2小時取出5 ml透析液，并用PBS定容至10 ml，在紫外分光光度計上檢測溶液在266 nm(5-FU的最佳吸收波長)的吸光值。根據(jù)標準工作曲線式將測得的吸光值(Y)計算成對應(yīng)的濃度(C，μg/ml)。

載藥囊泡包封率(encapsulation efficiency，EE)。EE%=(W總－W游離)/W總×100%=W包/W總×100%。其中，W總為藥物總量，W游離為游離藥物量。

2．6 囊泡的體外釋放實驗

量取制備好的囊泡混懸液及游離藥物溶液(兩者所含總藥量相等)裝入透析袋中，放入裝有250 ml人工胃/腸液的智能溶出儀中，透析袋置于攪拌漿的下端，設(shè)定溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min，模擬體內(nèi)環(huán)境進行藥物緩釋性實驗。于1～12 h每小時取樣1次，吸取釋放液5 ml，同時補充5 ml人工胃/腸液。測定釋放液的吸光度，根據(jù)吸光度與濃度間關(guān)系式，從而求得氟尿嘧啶的累積釋放量。

3 結(jié)果與討論

3．1 Gemini表面活性劑對囊泡粒度分布的影響

固定 Span60、CHOL 用量(Span 60:65 nmol，CHOL:58 nmol)，考察不同 Gemini表面活性劑的量(分別為 0，10，30，60，80，100，130，160 nmol)對囊泡粒度分布的影響，結(jié)果見表1，圖3。

表1 Gemini表面活性劑用量對囊泡粒徑大小的影響

圖3 含有Gemini的囊泡粒徑分布圖

由表1可見，Gemini表面活性劑對囊泡的粒度大小影響不顯著，但對粒度分布具有較顯著的影響。加入Gemini表面活性劑后，當Gemini表面活性劑濃度較低時，隨著Gemini表面活性劑濃度的升高，囊泡Pdi值明顯變小，說明雙子表面活性劑的加入，增加了囊泡體系的均勻度。但當Gemini表面活性劑濃度增加到一定程度時，其Pdi值反而增加，即Gemini表面活性劑濃度過高時，囊泡粒度分布均勻性又有所下降。這可能是Gemini表面活性劑具有較強的分散能力，在低濃度時與傳統(tǒng)表面活性劑表現(xiàn)出良好的協(xié)同效應(yīng)，起到良好的成囊作用，增加了囊泡膜的緊密程度，從而增加了其粒度分布的均勻性。當濃度過高時，由于Gemini表面活性劑的強分散能力，使其與Span及膽固醇之間的協(xié)同成膜能力降低，增加了囊泡的多分散性。

3．2 Gemini表面活性劑對囊泡zeta電位的影響

固定 Span60、CHOL 用量(Span 60:65 nmol，CHOL:58 nmol)，考察不同 Gemini表面活性劑的量(分別為 0，10，30，60，80，100，130，160 nmol)對囊泡zeta電位的影響，結(jié)果見表2，圖4。

表2 Gemini表面活性劑用量對囊泡zeta電位的影響

圖4 含Gemini表面活性劑囊泡zeta電位測量結(jié)果

由表2可見，Gemini表面活性劑的加入在一定程度上降低了囊泡表面的電荷量，但其zeta電位并未隨Gemini濃度的變化出現(xiàn)大幅度改變。這可能是由于Gemini表面活性劑的特殊結(jié)構(gòu)，其介電常數(shù)將與其它非離子表面活性劑明顯不同，從而影響了囊泡與分散介質(zhì)界面間電荷的分布，故而影響了囊泡表面的zeta電位。

3．3 Gemini表面活性劑對囊泡包封率的影響

Gmini表面活性劑用量對囊泡包封率的影響結(jié)果見表3。

表3 Gemini表面活性劑對囊泡包封率的影響

由表3可見，當Gemini表面活性劑濃度較小時，隨著Gemini表面活性劑濃度的升高，囊泡的包封率增大。這可能是Gemini表面活性劑在低濃度時與傳統(tǒng)表面活性劑表現(xiàn)出良好的協(xié)同效應(yīng)，起到良好的成囊作用，增加了囊泡膜的緊密程度，從而增加了其包封率。當濃度過高時，由于Gemini表面活性劑的強分散能力，使其與Span80及膽固醇之間的協(xié)同成膜能力降低，包封率隨Gemini表面活性劑濃度的增加反而略有降低。

3．4 藥物濃度對包封率的影響

改變氟尿嘧啶濃度對Gemini表面活性劑囊泡包封率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 藥物濃度對包封率的影響

在氟尿嘧啶濃度較低時包封率隨氟尿嘧啶的濃度增加而上升，而在更高濃度時包封率又開始下降。這是因為在低濃度時，囊泡捕獲藥物分子的概率較小，因此隨著藥物濃度的增加，囊泡捕獲藥物分子的概率也增加，包封率隨之增加。但是在同樣的條件下產(chǎn)生的囊泡的數(shù)目是一定的，它對藥物分子的包封能力也是一定的，所以隨著藥物濃度的繼續(xù)增加，包封率反而下降。

由圖5可知，當藥物濃度為1．0 mg/ml時，可得到最大的包封率，故將這一濃度定為后期使用濃度。

3．5 水化體積的影響

固定Gemini表面活性劑、Span60、CHOL的量，改變水相體積(分別取 6，9，15，20，25 ml)，考察不同水相體積對囊泡性質(zhì)的影響。水化體積對包封率的影響結(jié)果，如圖6。

圖6 水化體積對囊泡包封率的影響

由圖6可知，水化體積較小時，包封率隨體積的增加逐漸增大，當水化體積為20 ml時，包封率有最大值。水化體積繼續(xù)增加，囊泡的包封率反而降低。這可能是因為水化體積過高，將導致體系中表面活性劑濃度過低，水化形成的囊泡較少。最佳水相體積為20 ml。

綜合上述實驗結(jié)果可知，囊泡的最佳處方組成為:Gemini 80 nmol，Span 65 nmol，膽固醇 58 nmol，藥物濃度1 mg/ml，水化體積為20 ml。

3．6 穩(wěn)定性實驗

將制成的氟尿嘧啶囊泡混懸液分成幾份貯存在冰箱上層(4℃)，分別于制得囊泡后(記為第1天)、3天、7天后取樣測其包封率。結(jié)果見圖7。

圖7 囊泡穩(wěn)定性實驗結(jié)果分析

由圖7可見，囊泡混懸體系的包封率隨放置時間的延長而逐漸降低，但降低的幅度并不大，且超過24 h后，囊泡的包封率基本不再隨放置時間的延長而降低。

只是由于隨著放置時間的延長，囊泡包封的藥物會發(fā)生部分的滲漏，因此將導致包封率的下降，但由于Gemini表面活性劑的加入，增加了囊泡的穩(wěn)定性及可能增加囊泡膜的緊密程度，故藥物滲漏程度較低，當時間較長時，可能是由于膜內(nèi)外藥物濃度差變小，故測得的包封率基本不再發(fā)生變化。

3．7 囊泡的體外釋放性研究

囊泡在不同pH條件下的體外釋放結(jié)果，見圖8，9。

圖8 囊泡在模擬胃液中的釋放度測定

圖9 囊泡在模擬腸液中的釋放度測定

由圖8，9可見，游離5-FU溶液和不加Gemini表面活性劑的囊泡在模擬腸液中釋放較快，2 h累釋放量分別為80%和50%左右，游離5-FU溶液在8 h時基本透出完全。含有Gemini表面活性劑的載藥囊泡體系在模擬胃液和模擬腸液中的釋放速率明顯低于游離藥物及Span類脂囊泡載藥體系，進一步說明了Gemini表面活性劑類脂囊泡的穩(wěn)定性及膜的緊密程度，包載于非離子Gemini表面活性劑囊泡體系中的藥物在模擬腸液及模擬胃液中具有明顯的緩釋作用及較好的pH穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

4．1 由Gemini表面活性劑、Span60、膽固醇制備氟尿嘧啶的最佳處方為:Gemini表面活性劑80 nmol、Span60 65 nmol、膽固醇58 nmol，藥物溶液濃度為1 mg/ml，水化體積為 20 ml。

4．2 Gemini表面活性劑可明顯改善囊泡體系的均勻度，增加對水溶性藥物的包封率，增加囊泡的穩(wěn)定性，對電位及粒度大小影響不顯著。

4．3 Gemini表面活性劑載藥囊泡體系在模擬體液中具有明顯的緩釋作用，因此Gemini表面活性劑可作為緩釋制劑的囊材，有著潛在的應(yīng)用價值。

［1］ Donatella Paolino，Donato Cosco，Rita Muzzalupo，et al．Innovative bola－surfactant niosomes as topical delivery systems of 5－?uorouracil for the treatment of skin cancer［J］．International Journal of Pharmaceutics，2008，353:233 –242．

［2］ 張景力，張志榮．紫杉醇磁性非離子表面活性劑囊泡的研制及其質(zhì)量評價［J］．中國醫(yī)院藥學雜志，2001，21(8):454 －455．

［3］ 杜美菊，凌翠霞，李娜，等．類脂囊泡作為頭孢噻肟鈉藥物載體的研究［J］．化學研究與應(yīng)用，2006，18(6):635 －637．

［4］ Lexander T A，F(xiàn)lorence A T．Pharmaceutical and biological characterization of doxorubicin－polymer conjugate entrapped insorbitan monostearate Span60 niosomes［M］．Colincetal:Harwood A-cademy Publishers，1995:239 － 253．

［5］ Jain C P，Vyas S P．Lymphatic delivery of noisome encapsulated methotrexate［J］．Pharmazie，1995，50:367 － 368．

［6］ Parthasarthi G，Udupa N，Umadevi P，et al．Niosome encapsulated of vincristine sulfate:improved anticancer activity with reduced toxicity in mice［J］．Journal of Drug Targeting，1996，34:124 －133．

［7］ Jain CP，Vyas SP．Preparation and characterization of noisomes containing rifampicin for lung targeting［J］．Microencapsulation，1995，12(4):401－ 407．

［8］ Luan L B，Zhu J B，Yu W P，et al．Studies on the preparation of camptothecin niosomes［J］．Acta Pharmaceutica Sinica，2002，37(1):59－ 62．

［9］ Yoshioka T，Horence A T．Preparation and properties of vesicles(niosomes)of sorbitan monoester(Span20，40，60 and 80)and sorbitan trimester(Span85)［J］．Int J Pharm，1994，105:1 － 6．

［10］ Yan H Y，Hao Y M，Zhao F L，et al．The non-ionic surfactant vesicles encapsulating drugs cefazolin sodium［J］．Chemistry，2002，7:467 － 471．

［11］ Liu C Y，Li L，Qiu F．Effects of Salt Concentration and Structure of Lipid Molecules on the Bending Rigidity of Multi-Component Charged Membranes［J］．Acta Chimica Sinica，2010，68(13):1325－1330．

［12］ 甘盈盈．磷脂囊泡和非離子囊泡的生成與融合［D］．揚州大學，2009．

［13］ Liu J L，Zhu G L，Liu H C．Study on the properties of vesicles in aqueous solution of perf luorinated surfactant［J］．Journal of Northeast Normal University，2002，34(2):55 －58．

［14］ Hangyi Liang，Chuanzhong Wang，Jianbin Huang．The research on the vesicle formation and transformation in novel Gemini surfactant systems，Colloids and Surfaces A:Physicochem［J］．Eng Aspects，2003，224:213 －220．