不結(jié)球白菜抗根腫病基因的分子標(biāo)記

張 慧， 徐 海，， 況媛媛， 宋 波， 陳龍正， 袁希漢

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014)

不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)起源于中國，在全國各地區(qū)尤其是南方廣泛栽培，是國內(nèi)重要的綠葉菜之一［1］。根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一種世界性病害，可導(dǎo)致十字花科作物根和莖吸收傳導(dǎo)養(yǎng)分受阻，生長不良，萎蔫、矮化，產(chǎn)量和質(zhì)量受損，以致減產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟損失［2-3］。近年來，由于不結(jié)球白菜栽培效益好，復(fù)種指數(shù)高，土傳病害逐漸成為制約不結(jié)球白菜發(fā)展的重要因素，根腫病由過去不常見的病害逐漸顯露出來，并呈蔓延趨勢。

目前，抗根腫病分子標(biāo)記研究主要集中在結(jié)球白菜和甘藍(lán)上，在這些研究中，分別利用RAPD及RFLP等標(biāo)記確定了與抗性有關(guān)的QTL［4］。在結(jié)球白菜上已經(jīng)對抗根腫病基因位點進(jìn)行了定位和基因圖譜的繪制?？剐赃z傳研究發(fā)現(xiàn)，不同的生理小種抗性遺傳機制不同［5］。甘藍(lán)苗期根腫病抗性遺傳規(guī)律結(jié)果表明，抗病性受3對以上基因控制，為不完全隱性［6］;而一些研究結(jié)果表明B.napus的根腫病抗性是由1～2個獨立的顯性基因所控制，這些顯性基因在大量抗性材料中都存在［7-9］。

由于不結(jié)球白菜根腫病為土傳病害，不易控制，目前關(guān)于不結(jié)球白菜根腫病方面的研究鮮有報道。因此開發(fā)抗根腫病特異分子標(biāo)記，對提高育種效率及開展分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。本研究利用引自結(jié)球白菜根腫病抗源，與不結(jié)球白菜進(jìn)行亞種間雜交，構(gòu)建分離群體，試圖篩選出抗根腫病特異分子標(biāo)記，并鑒別回交后代材料的根腫病抗性，為分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2010年，從韓國園藝研究所引進(jìn)1份結(jié)球白菜抗根腫病材料，其對根腫病表現(xiàn)為高抗。利用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所十字花科項目組不結(jié)球白菜研究材料T青做父本進(jìn)行轉(zhuǎn)育，得到F1代。2011年春，將雙親及F1代種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實驗田。對F1代植株進(jìn)行自交，得到F2代，F(xiàn)1代單株與不結(jié)球白菜親本回交，得到BC1代。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 各世代植株抗性鑒定 供試材料:T青、結(jié)球白菜抗源 CR、F1、F2及 BC1。每個材料3次重復(fù)，每次重復(fù)30株，隨機排列，播種于50孔穴盤。

待苗長到3～4片真葉時移栽營養(yǎng)缽，采用灌根法進(jìn)行抗性鑒定。用移液器吸取1 ml含5×107或1×108個孢子懸浮液10 ml，澆注到寄主根際周圍，接菌6周后，洗凈根部泥土，調(diào)查單株發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。田間病情分級參考前人研究分級標(biāo)準(zhǔn)［3］，略有改動。分級標(biāo)準(zhǔn)為:0級，未發(fā)生病害;1級，根系的須根、側(cè)根有較少細(xì)小腫瘤，主根未發(fā)生病害;2級，根系的須根腫瘤多，側(cè)根腫瘤較多，主根發(fā)病較輕，微微腫大;3級，根系的主根發(fā)病較重，異常腫大，大部分須根、側(cè)根腫瘤多;4級，根系的主根異常腫大，根系幾乎無須根。0級為抗病，其他均為感病。

1.2.2 DNA提取與檢測 采用CTAB法提取幼嫩葉片DNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至 15 ng/μl。

1.2.3 抗感池的構(gòu)建及引物篩選 采用BSA法，在F2群體中分別隨機選取10株抗病單株和10株感病單株，將其DNA等量混合，構(gòu)建抗病基因池和感病基因池，對引物進(jìn)行篩選，挑選在抗、感病池間能夠產(chǎn)生特異性條帶的引物。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序 ISSR反應(yīng)體系的總體積為20 μl，包括1 ×PCR buffer，模板 DNA 30 ng，Taq 酶 1 U、dNTP 250.00 μmol/L、引物 0.25 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L。

ISSR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，循環(huán)35次;72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.5 瓊脂糖電泳分離 反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物點入含0.5 μg/ml EB的2.0% 瓊脂糖凝膠中，以DNA marker V(Tiangen)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，紫外凝膠成像儀下照相。

1.2.6 ISSR標(biāo)記的連鎖分析 將篩選出的 ISSR標(biāo)記在雙親及F2分離群體中進(jìn)行驗證，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。親本為抗病有標(biāo)記帶和感病無標(biāo)記帶，F(xiàn)1代為感病有標(biāo)記帶，F(xiàn)2代中重組型個體為抗病無標(biāo)記帶、雜合感病無標(biāo)記帶和純合感病有標(biāo)記帶，根據(jù)F2代中重組型單株的數(shù)量計算交換率，再根據(jù)Kosambi作圖函數(shù)公式換算成Morgan遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 抗根腫病群體抗性鑒定

表1 親本、F1、F2和BC1群體對根腫病的抗性Table 1 Resistance to clubroot in parental lines，F(xiàn)1，F(xiàn)2and BC1

2.2 分子標(biāo)記的篩選

用90條ISSR引物進(jìn)行親本PCR擴增，其中21條ISSR引物可以在親本間穩(wěn)定擴增出清晰多態(tài)性條帶，占總引物數(shù)的23.0%。將能夠擴增到清晰多態(tài)性條帶的引物在抗感池中篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物873(5'-GACAGACAGACAGACA-3')可以在抗感基因池中擴增出多態(tài)性條帶，差異片段分別約為500 bp(圖1)。

圖1 引物873對親本和抗感DNA池的PCR電泳圖譜Fig.1 The electrophoresis pattern of parents and DNA pools by primer 873

由于抗根腫病基因是顯性基因，如果標(biāo)記與抗病基因緊密連鎖，純合抗病株和雜合抗病株都能擴增出此帶，而純合感病株應(yīng)沒有此帶。利用F2分離群體中的73個單株DNA對候選引物進(jìn)一步驗證，結(jié)果(圖2)顯示，標(biāo)記873在54份高抗根腫病單株(抗性0級)中，53個擴增出差異條帶，1個未擴增出差異條帶。同樣19份感病單株中，有6份擴增產(chǎn)生特異條帶。因此共有7株在標(biāo)記873與抗病基因之間發(fā)生重組，交換率為9.59%。依據(jù)Kogambi作圖函數(shù)公式得出標(biāo)記873與抗根腫病基因之間的遺傳距離為9.72 cM，命名為CR-873。

圖2 引物873對F2部分單株的擴增圖譜Fig.2 The PCR pattern of individuals of F2by primer 873

3 討論

根腫病抗性(Clubroot resistance，CR)的遺傳機制研究主要集中在白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜這3類蕓薹屬作物中。Laurens等認(rèn)為，甘藍(lán)的根腫病抗性由許多主效的等位基因所控制，這些等位基因是不完全顯性的，并具有明顯的加性遺傳效應(yīng)［10］。Voorrips等認(rèn)為控制甘藍(lán)根腫病抗性的基因都是隱性基因［11］。在B.rapa中發(fā)現(xiàn)了至少3個主要的根腫病抗性基因，這些基因是相對獨立的，且分別對不同的P.brassicae 生理小種發(fā)生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群體發(fā)現(xiàn)了B.napus根腫病抗性由1個主效基因和至少2個隱性基因控制［15］。王芳展等認(rèn)為，B.rapa大多數(shù)抗性基因都來自于歐洲飼料蕪菁，不同的品種獲得了1個或者多個的抗性基因，而這些基因之間又相對保持獨立［16］。本研究通過對抗根腫病多世代群體進(jìn)行抗性鑒定表明，不結(jié)球白菜抗性由顯性單基因控制。

Matsumoto等發(fā)現(xiàn)了2個RFLP標(biāo)記與1個CR基因CRa連鎖，并將其定位在 R3染色體34 cM的位置上［17］。Suwabe等利用 SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了Crr1和Crr2 2個CR位點［18］。Kuginuki等利用Siloga作為抗源，發(fā)現(xiàn)了3個RAPD標(biāo)記與CR位點連鎖［19］。ISSR技術(shù)可以比RFLP、SSR、RAPD等技術(shù)更多地揭示基因組中的多態(tài)性，并比RAPD穩(wěn)定，比AFLP簡便，是一種很好的DNA指紋標(biāo)記。本研究采用BSA和ISSR技術(shù)相結(jié)合來研究與不結(jié)球白菜抗根腫病基因連鎖的標(biāo)記，得到1個與根腫病抗性基因連鎖較緊密的分子標(biāo)記CR-873，遺傳距離為9.72 cM。本研究中得到的CR-873標(biāo)記與抗根腫病基因的遺傳距離仍然較遠(yuǎn)，可能是因為本研究中用于計算遺傳距離的群體偏小，一定程度上影響遺傳距離的準(zhǔn)確性。后續(xù)研究可以進(jìn)一步擴大群體并把獲得的可能與抗根腫病基因相連鎖的ISSR標(biāo)記轉(zhuǎn)換為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。

［1］農(nóng)業(yè)部.2006年全國各地蔬菜播種面積和產(chǎn)量［J］.中國蔬菜，2008，3(1):65-66.

［2］劉 勇，楊文強，黃小琴，等.影響小白菜根腫病菌休眠孢子萌發(fā)的主要因子研究［C］//戴玉成.《中國菌物學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文摘要集》.北京:科學(xué)出版社，2009:56-57.

［3］楊文強.小白菜根腫病發(fā)生規(guī)律、發(fā)病條件及病菌生物學(xué)特性研究［D］.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［4］MORGUCHI K，KIMIZUKA TAKAGI C，ISHII K，et al.A genetic map based on RAPD，RFLP，isozyme，morphological markers and QTL analysis for clubroot resistance in Brassica oleracea［J］.Breeding Science，1999，49(4):257-265.

［5］王芳展，劉亞培，張 梅，等.十字花科作物根腫病的侵染生理與抗性遺傳研究進(jìn)展［J］.中國油料作物學(xué)報，2012，34(2):215-224.

［6］司 軍，李成瓊，肖崇剛，等.甘藍(lán)根腫病抗性遺傳規(guī)律的研究［J］.園藝學(xué)報，2003，30(6):658-662.

［7］AYERS G W，LELACHEUR K E.Genetics of resistance in rutabaga to races of Plasmodiophora brassicae［J］.Canadian Journal of Plant Science，1972，52:897-900.

［8］DIXON G R，ROBINSON D L.The susceptibility of Brassica oleracea cultivars to Plasmodiophora brassicae(Clubroot)［J］.Plant Pathology，1986，35(1):101-107.

［9］RAHMAN H，SHAKIR A，JAKIR H M.Breeding for clubroot resistant spring canola(Brassica napus L.)for the Canadian prairies:Can the European winter canola cv.Mendel be used as a source of resistance［J］.Canadian Journal of Plant Science，2011，91(3):447-458.

［10］LAURENS F，THOMAS G.Inheritance of resistance to clubroot(Plasmodiophora brassicae Wor.)in kale(Brassica oleracea ssp.acephala L.)［J］.Hereditas，1993，119(3):253-262.

［11］VOORRIPS R E，VISSER D L.Examination of resistance to clubroot in accessions of Brassica oleracea using a glasshouse seedling test［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1993，99(5-6):269-276.

［12］TOXOPEUS H，JANSSEN A M P.Clubroot resistance in turnip.II.The slurry screening method and clubroot races in netherlands［J］.Euphytica，1975，24(3):751-755.

［13］TJALLINGII F.Testing clubroot resistance of turnips in netherlands and physiologic specialization of Plasmodiophora brassicae［J］.Euphytica，1965，14(1):1-22.

［14］YOSHIKAWA H.Studies on breeding of clubroot resistance in cole crops［J］.Bull Natl Res Inst Veg Ornam Plants Tea Jpn，1993，Series A:1-165.

［15］DIEDERICHSEN E，ECKMANN J，SCHONDELMEIER J，et al.Genetics of clubroot resistance in Brassica napus Mendel［J］.Acta Hort，2006，706:307-311.

［16］王芳展，劉亞培，張 梅，等.十字花科作物根腫病的侵染生理與抗性遺傳研究進(jìn)展［J］.中國油料作物學(xué)報，2012，34(2):215-224.

［17］MATSUMOTO E，YASUI C，OHI M，et al.Linkage analysis of RFLP markers for clubroot resistance and pigmentation in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)［J］.Euphytica，1998，104(2):79-86.

［18］SUWABE K，TSUKAZAKI H，IKETANI H，et al.Identification of two loci for resistance to clubroot(Plasmodiophora brassicae Woronin)in Brassica rapa L.［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107(6):997-1002.

［19］KUGINUKI Y，AJISAKA H，YUI M，et al.RAPD markers linked to a clubroot resistance locus in Brassica rapa L.［J］.Euphytica，1997，98(3):149-154.