轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊繁殖、遺傳及 hLYZ基因的表達(dá)穩(wěn)定性

喬 娜， 徐旭俊， 劉思國(guó)， 王學(xué)斌， 陳建泉， 成國(guó)祥

(1.上海杰隆生物工程股份有限公司，上海 201210;2.上海轉(zhuǎn)基因研究中心，上海 201210)

溶菌酶(Lysozyme)是廣泛分布于人和動(dòng)物機(jī)體組織和體液中的一種重要非特異性免疫因子，其在食品醫(yī)藥行業(yè)具有重要意義［1-4］。人溶菌酶(Human lysozyme，hLYZ)具有廣譜抗菌作用，對(duì)引發(fā)乳腺炎的金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等具有明顯抑制作用［5］。但人溶菌酶制備材料相當(dāng)有限，通常是從人奶、胎盤或尿液中少量提取，來源極其困難，無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)［6-8］。利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有較強(qiáng)抑菌作用的人溶菌酶成為近幾年的研究熱點(diǎn)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，轉(zhuǎn)人溶菌酶基因小鼠、豬、山羊、牛等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)先后獲得［9-13］。同時(shí)，牛、羊等哺乳動(dòng)物產(chǎn)奶量高，且在動(dòng)物乳汁蛋白質(zhì)合成過程中可以使伴隨表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行真核生物所特有的修飾和加工，使外源蛋白質(zhì)具有較高的生物活性，易于外源蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，牛、羊成為制備乳腺生物反應(yīng)器的理想動(dòng)物類型。

但有研究表明，轉(zhuǎn)基因山羊、小鼠乳汁內(nèi)高效表達(dá)異源蛋白質(zhì)后可對(duì)受體動(dòng)物正常乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成有一定影響，使泌乳性能下降。通過育種手段改善轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)性能，成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種新的目標(biāo)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊擴(kuò)群中的繁殖、外源基因遺傳、表達(dá)穩(wěn)定性等進(jìn)行分析，為轉(zhuǎn)基因山羊安全評(píng)價(jià)、轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊的繁育與檢測(cè)方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及來源

轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊G0代為上海轉(zhuǎn)基因研究中心利用體細(xì)胞克隆方法自主研發(fā)獲得的原代健康轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊，非轉(zhuǎn)基因普通奶山羊選購(gòu)自江蘇省徐州睢寧縣。以6只原代轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊?yàn)榛A(chǔ)，與普通奶山羊公羊自然交配，且從轉(zhuǎn)基因后代羊中挑選優(yōu)秀公、母羊，進(jìn)行兄妹交配或回交，逐漸組成 F1、F2和 F3代。

1.2 繁殖方式及數(shù)量

對(duì)各世代的子代數(shù)量、轉(zhuǎn)基因整合羔羊數(shù)、外源基因整合率等相關(guān)信息進(jìn)行記錄統(tǒng)計(jì)。G0代hLYZ母羊與正常健康非轉(zhuǎn)基因奶山羊公羊自然交配，所生后代中整合檢測(cè)呈陽(yáng)性個(gè)體，為F1代轉(zhuǎn)hLYZ基因羊。F1代hLYZ公羊與正常健康非轉(zhuǎn)基因奶山羊、G0代、F1代等轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊自然交配，所生后代中整合檢測(cè)呈陽(yáng)性個(gè)體，均定義為F2代轉(zhuǎn)hLYZ基因羊。F2代公羊與正常健康非轉(zhuǎn)基因奶山羊、G0代、F2代轉(zhuǎn)hLYZ基因母羊自然交配，所生后代中整合陽(yáng)性個(gè)體，為F3代轉(zhuǎn)hLYZ基因羊。各世代繁殖方式與數(shù)量詳見表1。

1.3 人溶菌酶的PCR整合檢測(cè)

分別取 F1、F2和 F3代待測(cè)羊血液 200 μl，使用北京天根公司的血液 DNA提取試劑盒(貨號(hào):DP318-02)提取DNA，使用TaKaRa公司的LaTaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。引物為上游引物:5'-CCTCATAATTCCCTGAGTAAG-3'，下 游 引 物:5'-TGACACTGAGGATTCCACATG-3'，擴(kuò)增目的片段大小約為850 bp。

PCR擴(kuò)增體系為:94℃ 5 min;94℃ 40 s，59℃40 s，72 ℃ 50 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物取 5 μl上樣，1%Agrose 120 V，電泳 20 min后，拍照鑒定。PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的個(gè)體，為整合轉(zhuǎn)基因羊。

1.4 轉(zhuǎn)基因母羊乳汁中hLYZ的Western-blot檢測(cè)

收集G0、F1和F2代hLYZ羊乳汁樣品，用無菌雙蒸水進(jìn)行恰當(dāng)稀釋，加入等體積的SDS上樣緩沖液，煮沸變性5 min，離心，取2 μl上清液進(jìn)行SDSPAGE電泳，凝膠濃度為12%;蛋白質(zhì)雜交一抗選用兔抗人溶菌酶(DAKO，A0099)，1∶3 000稀釋使用;二抗選用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime，A0208)，1∶3 000稀釋使用。雜交、洗膜等步驟參照常規(guī)Western-blot方法進(jìn)行。

1.5 轉(zhuǎn)基因母羊乳汁中hLYZ的ELISA檢測(cè)

G0、F1和 F2代 hLYZ 羊乳汁樣品 100 μl，選用AssayMax Human Lysozyme ELISA Kit(AssayPro，EL3020-1)進(jìn)行精確定量，檢測(cè)詳細(xì)步驟參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊的繁殖

根據(jù)不同交配類型，對(duì)各世代轉(zhuǎn)基因山羊的子代數(shù)量、轉(zhuǎn)基因整合情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。經(jīng)過3個(gè)繁殖周期，共獲得 F1代9只，轉(zhuǎn)基因整合率28.13%(9/32);F2代 140只，轉(zhuǎn)基因整合率 45.31%(140/309);F3代 22只，轉(zhuǎn)基因整合率 40.00%(22/55)(表1)。

表1 各世代羊數(shù)量及整合情況Table 1 Numbers of goats and transgenic goats in each generation

2.2 各世代轉(zhuǎn)基因山羊的PCR整合檢測(cè)與遺傳穩(wěn)定性分析

部分人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊PCR整合檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，圖中1～10為待檢測(cè)羊只PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對(duì)照選用普通奶山羊基因組擴(kuò)增產(chǎn)物。整合個(gè)體在850 bp處有清晰、特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。該檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，人溶菌酶基因能夠在轉(zhuǎn)基因羊世代間穩(wěn)定遺傳。

圖1 轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊PCR整合檢測(cè)圖Fig.1 PCR result for hLYZ transgenetic goats

2.3 hLYZ基因的表達(dá)穩(wěn)定性

為明確人溶菌酶在各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中的表達(dá)情況，分別應(yīng)用 Western-blot和 ELISA法對(duì)不同世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.1 Western-blot檢測(cè) 對(duì) G0、F1和 F23 個(gè)世代轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊乳汁樣品進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果(圖2)顯示，各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中均能檢測(cè)出與rhLYZ標(biāo)準(zhǔn)品(陽(yáng)性對(duì)照)大小一致的特異性條帶，正常奶山羊乳汁樣品(陰性對(duì)照)則無相應(yīng)條帶，表明各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中均表達(dá)出hLYZ蛋白質(zhì)。

圖2 轉(zhuǎn)hLYZ基因山羊乳汁中表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測(cè)圖Fig.2 Western-blot result for hLYZ in transgenic goat milk

2.3.2 轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ的ELISA檢測(cè)采用ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ含量，ELISA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為 0 μg/ml、0.093 μg/ml、0.187 μg/ml、0.375 μg/ml、0.750 μg/ml、1.500 μg/ml、3.000 μg/ml、6.000 μg/ml;待測(cè)乳汁樣品稀釋16 000倍，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)?？瞻讓?duì)照為EIA Diluent稀釋液(試劑盒提供)，陰性對(duì)照為普通奶山羊乳汁，陽(yáng)性對(duì)照為rhLYZ標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)結(jié)果顯示，待測(cè)樣品各孔吸光度均在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，且重復(fù)性較好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品各孔OD450值與濃度梯度值，以吸光度為Y軸，以濃度為X軸，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:Y=d+(ad)/［1+(x/c)^b］;式中:參數(shù) a=0.019，參數(shù) b=－0.958，參數(shù) c=0.118，參數(shù) d=2.666;R2=0.995 5。結(jié)果(表2)顯示，G0、F1和 F23 個(gè)世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ含量分別為3.46 g/L、2.28 g/L和 2.22 g/L。

表2 各世代轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中hLYZ表達(dá)量Table 2 HLYZ expression level in transgenic goat milk of each generation

3 討論

人溶菌酶在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，其中人乳中含量為50～250 mg/L。采用DNA重組技術(shù)，利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)人溶菌酶進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，最終獲得的人溶菌酶含量也不盡相同。酵母和霉菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)成分是人溶菌酶的最適作用底物之一，當(dāng)人溶菌酶在酵母或霉菌中表達(dá)時(shí)，人溶菌酶以活性形式存在，對(duì)酵母或霉菌細(xì)胞壁有溶解作用，從而影響工程菌的生長(zhǎng)發(fā)育，最終降低表達(dá)水平［6］。以大腸桿菌為宿主生產(chǎn)人溶菌酶，產(chǎn)量在2 mg/L以下;以霉菌作為宿主生產(chǎn)人溶菌酶，產(chǎn)量可達(dá)到40 mg/L［14-15］。目前，利用哺乳動(dòng)物體細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人溶菌酶已成為現(xiàn)實(shí)。本研究轉(zhuǎn)基因山羊能夠利用乳腺特異、高效的表達(dá)人溶菌酶(hLYZ)，經(jīng)過3個(gè)世代的繁育，hLYZ基因能夠在山羊世代間遺傳，且獲得的轉(zhuǎn)基因子代羊只健康狀況良好，3個(gè)世代母羊乳汁中hLYZ蛋白質(zhì)平均表達(dá)量大于2.00 g/L。

hLYZ基因位于人類第12染色體上，呈顯性效應(yīng)遺傳［6］。本研究G0代轉(zhuǎn)基因山羊是采用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得的攜帶有hLYZ基因的雜合子母羊。通過常規(guī)育種方法獲得的子代hLYZ整合雜合子羊，乳汁中能穩(wěn)定表達(dá)hLYZ蛋白質(zhì)，表明該外源基因在山羊染色體上的遺傳效應(yīng)與在人類染色體上相似。hLYZ基因的轉(zhuǎn)入，未對(duì)轉(zhuǎn)基因羊群的繁殖能力產(chǎn)生顯著影響，表明該基因能夠在山羊群體世代間遺傳和穩(wěn)定表達(dá)。

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