馬金友, 余 燕, 吳世秀, 張金洲, 趙恒章, 徐之勇
(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院動(dòng)物病毒研究所,河南 新鄉(xiāng) 453003)
2006年以來(lái)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的流行使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失,因此,通過(guò)“以防為主”,提高豬自身免疫能力以增強(qiáng)其抗病力,是解決豬病及抗生素等藥物濫用問(wèn)題的一條非常有效的途徑。目前,對(duì)于PRRSV免疫預(yù)防研究工作已經(jīng)取得了一些進(jìn)展[1-2],但對(duì)病毒入侵宿主細(xì)胞后,一些相關(guān)免疫因子對(duì)病毒感染過(guò)程中的囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)是如何調(diào)控的還知之甚少,尤其在病毒的復(fù)制或參與病毒防御等方面。
二磷酸腺苷-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)屬于小G蛋白質(zhì)Ras家族,最初命名是根據(jù)它能作為霍亂毒素催化GS蛋白質(zhì)ADP核糖基化反應(yīng)的輔助因子,在N端第二位(通常為氨基酸G)發(fā)生肉豆蔻?;?]。研究發(fā)現(xiàn)ARFs在細(xì)胞囊泡運(yùn)輸、磷脂代謝、細(xì)胞骨架重組及調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬等方面起重要作用[4-5],近期報(bào)道哺乳動(dòng)物的一些ARF 成員與病毒的感染有關(guān)[6-7]。ARF6 作為 ARFs的重要成員之一,其功能由ARF6的效應(yīng)子GTP酶激活蛋白質(zhì)GAPs和鳥(niǎo)苷交換因子GEFs相互協(xié)調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)[8-9]。
ARF6效應(yīng)子可以特異性地通過(guò)PH結(jié)構(gòu)域與3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PtdIns(3,4,5)P(3)]相結(jié)合,使其蛋白質(zhì)向細(xì)胞膜上遷移,通過(guò) Ras-Raf-MEK-ERK1/2途徑調(diào)控細(xì)胞功能,從而參與到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中[9-10],ARF6 通過(guò)它的 GAP-Centaurin-α1 行使調(diào)控功能[11],間接地參與到病毒感染和抗病毒過(guò)程中[12],同時(shí),也是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) PI3-K 途徑下游的重要成員[10,13],因此 ARF6 效應(yīng)子可能與豬抗病毒免疫密切相關(guān)。為了了解ARF6在PRRSV感染中的免疫防御作用和調(diào)節(jié)機(jī)制,本試驗(yàn)擬通過(guò)豬arf6基因的克隆與分析,構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體以獲得抗血清,為進(jìn)一步研究豬ARF6在PRRSV感染過(guò)程中的調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ)。
限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoRⅠ(TaKaRa公司生產(chǎn))、反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV(TaKaRa公司生產(chǎn))、Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司生產(chǎn))、PMD18-T 載體(TaKaRa公司生產(chǎn))、T4 Ligase(TaKaRa公司生產(chǎn))、DL2000 marker(TaKaRa公司生產(chǎn))、6 mer隨機(jī)引物(TaKaRa公司生產(chǎn))、質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司生產(chǎn))、DNA回收試劑盒(Omega公司生產(chǎn))、親和層析純化柱及相關(guān)試劑(Novagen公司生產(chǎn))、100 bp Marker(Tiangen公司生產(chǎn))等均購(gòu)于鄭州久是生物有限責(zé)任公司;瓊脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司;槍頭和離心管(Axygen公司生產(chǎn))購(gòu)于北京鼎國(guó)工程公司;其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。PGEX-4T-2載體和大腸桿菌(Escherichia coli Top10、BL21)由河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室保藏。
從河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院取疑似PRRSV感染的杜洛克豬肺、腦、心臟等組織,液氮凍存帶回實(shí)驗(yàn)室處理。
根據(jù)NCBI(National center for biotechnology information)對(duì)豬arf6(FJ455238)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增arf6全長(zhǎng)ORF引物[SArf6F(上游引物):5'-GCGATGGGGAAGGTGCTATC-3'和 SArf6R(下游引物):5'-GCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG-3']和原核表達(dá)引物[SArf6F1(上 游 引 物):5'-CC GGATCCATGGGGAAGGTGCTATC-3'和 SArf6R1(下 游 引 物):5'-GC GAATTCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG-3', 下劃線為酶切位點(diǎn)]。引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。根據(jù)豬actin(XM_003124280)序列設(shè)計(jì)組織分布的半定量PCR引物[SactinF(上游 引 物):5'-AAGGACCTCTACGCCAACACG-3' 和SactinR(下游引物):5'-GTCGTACTCCTGCTTGCTGATCC-3']。
1.3.1 豬arf6基因擴(kuò)增
1.3.1.1 總RNA提取 取適當(dāng)組織(100 mg以下)于研缽(180℃烘烤3 h)中加入液氮充分研磨,然后加入1.0 ml Trizol(Invitrogen)混勻,轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中,室溫放置10 min;12 000 g,4℃離心10 min;上清液轉(zhuǎn)移至離心管,每1.0 ml Trizol加入0.2 ml氯仿,劇烈搖動(dòng)15 s左右,室溫放置8 min左右;12 000 g,4℃離心15 min;上層水相轉(zhuǎn)移至離心管中,加入0.5 ml異丙醇混勻,室溫放置8 min;12 000 g,4℃離心8 min;棄上清液,1.0 ml 75%乙醇洗 1 min,7 500 g,4 ℃離心5 min,重復(fù)洗1 次;棄上清液,空氣干燥3 min,加入60.00 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀。
1.3.1.2 cDNA合成 總體系為20.00 μl。配制1.00 μl 6 mer隨機(jī)引物 (100 ng/μl),4.00 μg 總RNA,1.00 μl 10 mmol/L dNTP 混合物,用 DEPC 水補(bǔ)充至14.00 μl;PCR儀中65℃加熱5 min,然后冰浴至少1 min;輕微離心一下,然后加入以下成分:4.00 μl 5 × First-strand buffer,1.00 μl Rnase inhibitor,1.00 μl反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV;PCR儀中25℃溫浴5 min,42℃溫浴60 min,70 ℃加熱15 min,4 ℃后保存于冰箱中備用。
1.3.1.3 arf6基因擴(kuò)增 PCR反應(yīng)管中分別加入以下成分:10 × Ex Taq buffer 2.50 μl,2.5 mmol/L dNTP 混合物2.00 μl,上、下游引物各1.00 μl,10 倍稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.00 μl,Ex Taq DNA Polymerase 0.25 μl,補(bǔ)充滅菌三蒸水至 25.00 μl。PCR 反應(yīng)程序如下:95 ℃,3 min;95 ℃ 35 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸5 min,4℃終止。
1.3.2 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、連接和測(cè)序 檢測(cè)擴(kuò)增的目的片段,根據(jù)DNA回收試劑盒說(shuō)明回收目的片段;0.5 ml離心管中依次加入:載體(PMD18-T)0.40 μl,目的片段 6.00 μl,10 × Ligation buffer 1.00 μl,T4 Ligase 0.60 μl,滅菌三蒸水補(bǔ)充至 10.00 μl,16℃連接6 h;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10細(xì)菌和轉(zhuǎn)化細(xì)菌的檢測(cè)及測(cè)序,正確測(cè)序產(chǎn)物質(zhì)粒的提取、保存。
1.3.3 豬arf6組織分布 提取豬下丘腦、胸腺、肺、肺部淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌肉、十二指腸、空腸、回腸等組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以actin為內(nèi)標(biāo)半定量PCR檢測(cè)arf6的組織分布。
1.3.4 序列分析 根據(jù)Blast程序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)分析核酸序列,Signal P 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽。
1.3.5 豬ARF6融合蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)
1.3.5.1 arf6基因表達(dá)序列的擴(kuò)增 擴(kuò)增引物為SArf6F1和 SArf6R1,模板為含 arf6序列的質(zhì)粒PMD18-T-arf6,其它成分和程序參照方法 1.3.1.3的成分和步驟。
1.3.5.2 擴(kuò)增的arf6序列和表達(dá)載體的酶切及回收1.5 ml Eppendorf管中分別依次加入:內(nèi)切酶緩沖液 5.00 μl;DNA 片段和 PET-4T-2 分別為 43.00 μl;BamHⅠ1.00 μl,EcoRⅠ1.00 μl,37 ℃酶切2.5 h。酶切后的片段回收按照DNA回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
1.3.5.3 表達(dá)載體和目的片段連接、轉(zhuǎn)化及檢測(cè)0.5 ml離心管中依次加入:酶切載體(PGEX-4T-2)1.50 μl,待連接的酶切 arf6 片段 6.50 μl,10 × Ligation buffer 1.00 μl,T4 Ligase 1.00 μl,總體積 10.00 μl,16℃連接6 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10細(xì)菌,轉(zhuǎn)化細(xì)菌的菌落檢測(cè)和質(zhì)粒雙酶切檢測(cè)驗(yàn)證,符合要求的菌落測(cè)序,正確測(cè)序產(chǎn)物質(zhì)粒的提取、保存。
1.3.5.4 豬ARF6-GST重組融合蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒于BL21細(xì)菌,挑選單菌落于2.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培8 h;加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.2 mmol/L,37℃繼續(xù)搖培3 h;取菌液1.0 ml,離心去上清液,加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液 50.00 μl,混勻;沸水浴 5 min,10 000 g 離心 1 min;取 8.00 μl進(jìn)行 SDS-PAGE,檢測(cè)重組融合蛋白質(zhì)的表達(dá);表達(dá)的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行可溶性分析。
1.3.5.5 豬ARF6-GST重組融合表達(dá)蛋白質(zhì)的純化 挑選檢測(cè)表達(dá)的菌落接種于5.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培過(guò)夜;1∶100接種于200.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培3 h,加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L,18℃繼續(xù)搖培16 h;收取菌液4℃,6 000 g離心10 min;去上清液,加入磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.36)15.0 ml,懸浮細(xì)菌;冰浴中超聲破碎,4℃,12 000 g離心20 min;上清液轉(zhuǎn)移至新管中,加入1.0 ml GST純化介質(zhì),4℃混勻3 h;上柱,收集流過(guò)液,PBS緩沖液洗柱,至流過(guò)液OD280接近于零;4.0 ml谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫,收集洗脫液,SDS-PAGE鑒定純化的蛋白質(zhì)。
通過(guò)豬肺臟和腦組織總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和基因擴(kuò)增,得到了與目的基因片段大小一致的條帶(圖1),測(cè)序比對(duì)后確認(rèn)為豬arf6基因,大小為530 bp左右。
圖1 豬arf6基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of arf6 gene from swine
豬arf6基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為528 bp開(kāi)放閱讀框,預(yù)測(cè)編碼175個(gè)氨基酸,理論分子質(zhì)量約為20 080,pI為8.97。通過(guò)其序列的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),豬ARF6蛋白質(zhì)含有典型的p loop、Switch區(qū)、Interswitch區(qū)和N端疏水區(qū)的Hasp,同時(shí),在N端第二位含有可被肉豆蔻?;母拾彼?。這些結(jié)構(gòu)特征反應(yīng)了豬ARF6在進(jìn)化上是高度保守的。信號(hào)肽預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)序列沒(méi)有信號(hào)肽序列。
分別以豬下丘腦、胸腺、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肺、肺部淋巴結(jié)、十二指腸、肌肉、空腸、回腸cDNA為模版,以actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo),進(jìn)行arf6基因PCR檢測(cè)。結(jié)果(圖2)顯示,12種組織中均可以檢測(cè)到arf6基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),說(shuō)明該基因的表達(dá)沒(méi)有組織特異性。
圖2 豬arf6基因的組織分布Fig.2 Tissue transcriptional profile of arf6 gene from swine
由于ARF6是細(xì)胞中囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾蛋白質(zhì),可通過(guò)它的效應(yīng)子—Centaurin-α1對(duì)病毒的入侵起著重要的調(diào)控作用,為了進(jìn)一步研究ARF6的功能及構(gòu)建ARF6原核表達(dá)載體進(jìn)行融合蛋白質(zhì)表達(dá)以獲得抗血清。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物通過(guò)PCR從質(zhì)粒PMD18-T-arf6中克隆表達(dá)序列,雙酶切后連接到PGEX-4T-2載體上,菌落PCR獲得了和目的片段大小一致的條帶,挑選菌落培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒雙酶切圖譜(圖3)進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體的正確性。根據(jù)克隆的arf6基因,我們成功構(gòu)建了豬ARF6原核表達(dá)載體用于融合蛋白質(zhì)ARF6-GST的表達(dá)。挑選構(gòu)建好的表達(dá)載體PGEX-4T-arf6轉(zhuǎn)化的細(xì)菌,通過(guò)一系列的誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性的融合蛋白質(zhì),并經(jīng)過(guò)親和層析柱純化獲得了ARF6-GST融合蛋白質(zhì)(圖4)。該融合蛋白質(zhì)經(jīng)濃度測(cè)定可作為制備抗血清的抗原。
圖3 ARF6-GST融合蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant fusion protein plasmid ARF6-GST
圖4 ARF6-GST融合蛋白質(zhì)的可溶性分析與純化Fig.4 Solubility analysis and purification of the expressed fusion protein ARF6-GST
ARFs是一類高度保守的GTP激酶,是分泌性囊泡形成的主要因子,同時(shí)在細(xì)胞器的形成、生物合成、胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬及物質(zhì)運(yùn)輸中起重要的調(diào)控作用,尤其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的囊泡運(yùn)輸過(guò)程是必不可少的[4-5]。哺乳動(dòng)物的一些ARF成員被病毒挾持參與了病毒裝配、復(fù)制和釋放[6-7]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)具有導(dǎo)致懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等嚴(yán)重病癥特征,尤其2006年后該病的暴發(fā)使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失。研究中發(fā)現(xiàn)PRRSV感染早期豬arfs基因表達(dá)明顯上調(diào)。另外,我們克隆了豬arf6開(kāi)放閱讀框序列并構(gòu)建了他們的原核表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)該ARF6具有其他動(dòng)物的保守結(jié)構(gòu)域且序列結(jié)構(gòu)也很保守,說(shuō)明這些小的GTP激酶在細(xì)胞內(nèi)部執(zhí)行著非常重要的功能。雖然ARF6在一些哺乳動(dòng)物的病毒感染中扮演著不同的角色,但豬ARF6與病毒的關(guān)系目前還沒(méi)有具體的研究,但是我們?nèi)允强梢灶A(yù)見(jiàn)ARF6可能與豬的相關(guān)病毒入侵有著密切的相關(guān)性。
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