• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬二磷酸腺苷-核糖基化因子6的克隆與原核表達

    2013-08-02 00:51:20馬金友吳世秀張金洲趙恒章徐之勇
    江蘇農業(yè)學報 2013年3期
    關鍵詞:融合

    馬金友, 余 燕, 吳世秀, 張金洲, 趙恒章, 徐之勇

    (1.河南科技學院動物科學學院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學院動物病毒研究所,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    2006年以來高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的流行使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失,因此,通過“以防為主”,提高豬自身免疫能力以增強其抗病力,是解決豬病及抗生素等藥物濫用問題的一條非常有效的途徑。目前,對于PRRSV免疫預防研究工作已經取得了一些進展[1-2],但對病毒入侵宿主細胞后,一些相關免疫因子對病毒感染過程中的囊泡運輸系統(tǒng)是如何調控的還知之甚少,尤其在病毒的復制或參與病毒防御等方面。

    二磷酸腺苷-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)屬于小G蛋白質Ras家族,最初命名是根據它能作為霍亂毒素催化GS蛋白質ADP核糖基化反應的輔助因子,在N端第二位(通常為氨基酸G)發(fā)生肉豆蔻酰基化[3]。研究發(fā)現ARFs在細胞囊泡運輸、磷脂代謝、細胞骨架重組及調節(jié)細胞吞噬等方面起重要作用[4-5],近期報道哺乳動物的一些ARF 成員與病毒的感染有關[6-7]。ARF6 作為 ARFs的重要成員之一,其功能由ARF6的效應子GTP酶激活蛋白質GAPs和鳥苷交換因子GEFs相互協(xié)調來實現[8-9]。

    ARF6效應子可以特異性地通過PH結構域與3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PtdIns(3,4,5)P(3)]相結合,使其蛋白質向細胞膜上遷移,通過 Ras-Raf-MEK-ERK1/2途徑調控細胞功能,從而參與到信號轉導通路中[9-10],ARF6 通過它的 GAP-Centaurin-α1 行使調控功能[11],間接地參與到病毒感染和抗病毒過程中[12],同時,也是細胞信號轉導 PI3-K 途徑下游的重要成員[10,13],因此 ARF6 效應子可能與豬抗病毒免疫密切相關。為了了解ARF6在PRRSV感染中的免疫防御作用和調節(jié)機制,本試驗擬通過豬arf6基因的克隆與分析,構建該基因的原核表達載體以獲得抗血清,為進一步研究豬ARF6在PRRSV感染過程中的調控作用提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    限制性內切酶BamH I與EcoRⅠ(TaKaRa公司生產)、反轉錄酶 M-MLV(TaKaRa公司生產)、Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司生產)、PMD18-T 載體(TaKaRa公司生產)、T4 Ligase(TaKaRa公司生產)、DL2000 marker(TaKaRa公司生產)、6 mer隨機引物(TaKaRa公司生產)、質粒提取試劑盒(Omega公司生產)、DNA回收試劑盒(Omega公司生產)、親和層析純化柱及相關試劑(Novagen公司生產)、100 bp Marker(Tiangen公司生產)等均購于鄭州久是生物有限責任公司;瓊脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等均購自上海生工生物工程技術有限公司;槍頭和離心管(Axygen公司生產)購于北京鼎國工程公司;其他常用試劑均為國產分析純試劑。PGEX-4T-2載體和大腸桿菌(Escherichia coli Top10、BL21)由河南科技學院動物科學學院獸醫(yī)學平臺實驗室保藏。

    從河南科技學院動物科學學院取疑似PRRSV感染的杜洛克豬肺、腦、心臟等組織,液氮凍存帶回實驗室處理。

    1.2 引物設計

    根據NCBI(National center for biotechnology information)對豬arf6(FJ455238)序列設計擴增arf6全長ORF引物[SArf6F(上游引物):5'-GCGATGGGGAAGGTGCTATC-3'和 SArf6R(下游引物):5'-GCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG-3']和原核表達引物[SArf6F1(上 游 引 物):5'-CC GGATCCATGGGGAAGGTGCTATC-3'和 SArf6R1(下 游 引 物):5'-GC GAATTCTCATTAGGATTTGTAGTTAGAGG-3', 下劃線為酶切位點]。引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。根據豬actin(XM_003124280)序列設計組織分布的半定量PCR引物[SactinF(上游 引 物):5'-AAGGACCTCTACGCCAACACG-3' 和SactinR(下游引物):5'-GTCGTACTCCTGCTTGCTGATCC-3']。

    1.3 方法

    1.3.1 豬arf6基因擴增

    1.3.1.1 總RNA提取 取適當組織(100 mg以下)于研缽(180℃烘烤3 h)中加入液氮充分研磨,然后加入1.0 ml Trizol(Invitrogen)混勻,轉移至1.5 ml離心管中,室溫放置10 min;12 000 g,4℃離心10 min;上清液轉移至離心管,每1.0 ml Trizol加入0.2 ml氯仿,劇烈搖動15 s左右,室溫放置8 min左右;12 000 g,4℃離心15 min;上層水相轉移至離心管中,加入0.5 ml異丙醇混勻,室溫放置8 min;12 000 g,4℃離心8 min;棄上清液,1.0 ml 75%乙醇洗 1 min,7 500 g,4 ℃離心5 min,重復洗1 次;棄上清液,空氣干燥3 min,加入60.00 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀。

    1.3.1.2 cDNA合成 總體系為20.00 μl。配制1.00 μl 6 mer隨機引物 (100 ng/μl),4.00 μg 總RNA,1.00 μl 10 mmol/L dNTP 混合物,用 DEPC 水補充至14.00 μl;PCR儀中65℃加熱5 min,然后冰浴至少1 min;輕微離心一下,然后加入以下成分:4.00 μl 5 × First-strand buffer,1.00 μl Rnase inhibitor,1.00 μl反轉錄酶M-MLV;PCR儀中25℃溫浴5 min,42℃溫浴60 min,70 ℃加熱15 min,4 ℃后保存于冰箱中備用。

    1.3.1.3 arf6基因擴增 PCR反應管中分別加入以下成分:10 × Ex Taq buffer 2.50 μl,2.5 mmol/L dNTP 混合物2.00 μl,上、下游引物各1.00 μl,10 倍稀釋的反轉錄產物 2.00 μl,Ex Taq DNA Polymerase 0.25 μl,補充滅菌三蒸水至 25.00 μl。PCR 反應程序如下:95 ℃,3 min;95 ℃ 35 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,30個循環(huán);72℃再延伸5 min,4℃終止。

    1.3.2 基因擴增產物的回收、連接和測序 檢測擴增的目的片段,根據DNA回收試劑盒說明回收目的片段;0.5 ml離心管中依次加入:載體(PMD18-T)0.40 μl,目的片段 6.00 μl,10 × Ligation buffer 1.00 μl,T4 Ligase 0.60 μl,滅菌三蒸水補充至 10.00 μl,16℃連接6 h;連接產物轉化Top 10細菌和轉化細菌的檢測及測序,正確測序產物質粒的提取、保存。

    1.3.3 豬arf6組織分布 提取豬下丘腦、胸腺、肺、肺部淋巴結、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌肉、十二指腸、空腸、回腸等組織總RNA,反轉錄為cDNA,以actin為內標半定量PCR檢測arf6的組織分布。

    1.3.4 序列分析 根據Blast程序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)分析核酸序列,Signal P 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白質的保守結構域及信號肽。

    1.3.5 豬ARF6融合蛋白質原核表達載體構建與表達

    1.3.5.1 arf6基因表達序列的擴增 擴增引物為SArf6F1和 SArf6R1,模板為含 arf6序列的質粒PMD18-T-arf6,其它成分和程序參照方法 1.3.1.3的成分和步驟。

    1.3.5.2 擴增的arf6序列和表達載體的酶切及回收1.5 ml Eppendorf管中分別依次加入:內切酶緩沖液 5.00 μl;DNA 片段和 PET-4T-2 分別為 43.00 μl;BamHⅠ1.00 μl,EcoRⅠ1.00 μl,37 ℃酶切2.5 h。酶切后的片段回收按照DNA回收試劑盒說明進行。

    1.3.5.3 表達載體和目的片段連接、轉化及檢測0.5 ml離心管中依次加入:酶切載體(PGEX-4T-2)1.50 μl,待連接的酶切 arf6 片段 6.50 μl,10 × Ligation buffer 1.00 μl,T4 Ligase 1.00 μl,總體積 10.00 μl,16℃連接6 h。連接產物轉化Top 10細菌,轉化細菌的菌落檢測和質粒雙酶切檢測驗證,符合要求的菌落測序,正確測序產物質粒的提取、保存。

    1.3.5.4 豬ARF6-GST重組融合蛋白質的表達轉化重組質粒于BL21細菌,挑選單菌落于2.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培8 h;加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.2 mmol/L,37℃繼續(xù)搖培3 h;取菌液1.0 ml,離心去上清液,加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液 50.00 μl,混勻;沸水浴 5 min,10 000 g 離心 1 min;取 8.00 μl進行 SDS-PAGE,檢測重組融合蛋白質的表達;表達的融合蛋白質進行可溶性分析。

    1.3.5.5 豬ARF6-GST重組融合表達蛋白質的純化 挑選檢測表達的菌落接種于5.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培過夜;1∶100接種于200.0 ml LB(含100 IU/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基37℃搖培3 h,加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L,18℃繼續(xù)搖培16 h;收取菌液4℃,6 000 g離心10 min;去上清液,加入磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.36)15.0 ml,懸浮細菌;冰浴中超聲破碎,4℃,12 000 g離心20 min;上清液轉移至新管中,加入1.0 ml GST純化介質,4℃混勻3 h;上柱,收集流過液,PBS緩沖液洗柱,至流過液OD280接近于零;4.0 ml谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫,收集洗脫液,SDS-PAGE鑒定純化的蛋白質。

    2 結果

    2.1 豬arf6基因的克隆及結構特征

    通過豬肺臟和腦組織總RNA的提取、反轉錄和基因擴增,得到了與目的基因片段大小一致的條帶(圖1),測序比對后確認為豬arf6基因,大小為530 bp左右。

    圖1 豬arf6基因RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of arf6 gene from swine

    豬arf6基因包含一個長度為528 bp開放閱讀框,預測編碼175個氨基酸,理論分子質量約為20 080,pI為8.97。通過其序列的保守結構域分析發(fā)現,豬ARF6蛋白質含有典型的p loop、Switch區(qū)、Interswitch區(qū)和N端疏水區(qū)的Hasp,同時,在N端第二位含有可被肉豆蔻?;母拾彼?。這些結構特征反應了豬ARF6在進化上是高度保守的。信號肽預測該蛋白質序列沒有信號肽序列。

    2.2 豬arf6的組織分布

    分別以豬下丘腦、胸腺、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肺、肺部淋巴結、十二指腸、肌肉、空腸、回腸cDNA為模版,以actin基因為內標,進行arf6基因PCR檢測。結果(圖2)顯示,12種組織中均可以檢測到arf6基因的轉錄表達,說明該基因的表達沒有組織特異性。

    圖2 豬arf6基因的組織分布Fig.2 Tissue transcriptional profile of arf6 gene from swine

    2.3 豬ARF6融合蛋白質原核表達載體構建、表達與純化

    由于ARF6是細胞中囊泡運輸的重要小G蛋白質,可通過它的效應子—Centaurin-α1對病毒的入侵起著重要的調控作用,為了進一步研究ARF6的功能及構建ARF6原核表達載體進行融合蛋白質表達以獲得抗血清。本試驗設計原核表達引物通過PCR從質粒PMD18-T-arf6中克隆表達序列,雙酶切后連接到PGEX-4T-2載體上,菌落PCR獲得了和目的片段大小一致的條帶,挑選菌落培養(yǎng)后提取的質粒雙酶切圖譜(圖3)進一步證實構建融合蛋白質表達載體的正確性。根據克隆的arf6基因,我們成功構建了豬ARF6原核表達載體用于融合蛋白質ARF6-GST的表達。挑選構建好的表達載體PGEX-4T-arf6轉化的細菌,通過一系列的誘導表達獲得可溶性的融合蛋白質,并經過親和層析柱純化獲得了ARF6-GST融合蛋白質(圖4)。該融合蛋白質經濃度測定可作為制備抗血清的抗原。

    圖3 ARF6-GST融合蛋白質表達質粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant fusion protein plasmid ARF6-GST

    圖4 ARF6-GST融合蛋白質的可溶性分析與純化Fig.4 Solubility analysis and purification of the expressed fusion protein ARF6-GST

    3 討論

    ARFs是一類高度保守的GTP激酶,是分泌性囊泡形成的主要因子,同時在細胞器的形成、生物合成、胚胎發(fā)育、調節(jié)細胞吞噬及物質運輸中起重要的調控作用,尤其內質網和高爾基體之間的囊泡運輸過程是必不可少的[4-5]。哺乳動物的一些ARF成員被病毒挾持參與了病毒裝配、復制和釋放[6-7]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)具有導致懷孕母豬發(fā)生流產、早產和死胎等嚴重病癥特征,尤其2006年后該病的暴發(fā)使養(yǎng)豬業(yè)遭受了重大損失。研究中發(fā)現PRRSV感染早期豬arfs基因表達明顯上調。另外,我們克隆了豬arf6開放閱讀框序列并構建了他們的原核表達載體,發(fā)現該ARF6具有其他動物的保守結構域且序列結構也很保守,說明這些小的GTP激酶在細胞內部執(zhí)行著非常重要的功能。雖然ARF6在一些哺乳動物的病毒感染中扮演著不同的角色,但豬ARF6與病毒的關系目前還沒有具體的研究,但是我們仍是可以預見ARF6可能與豬的相關病毒入侵有著密切的相關性。

    [1]LUO R,FANG L R,JIN H,et al.Antiviral activity of type I and type III interferons against porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)[J].Antiviral Res,2011,91(2):99-101.

    [2]CRUZ J L G,Zü?IGA S,BéCARES M,et al.Vectored vaccines to protect against PRRSV[J].Virus Res,2010,154(1-2):150-160.

    [3]SCHLEIFER L S,KAHN R A,HANSKI E,et al.Requirements for cholera toxin-dependent ADP-ribosylation of the purified regulatory component of adenylate cyclase[J].J Biol Chem,1982,257(1):20-23.

    [4]DSOUZA-SCHOREY C,CHAVRIER P.ARF proteins:roles in membrane traffic and beyond [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(5):347-358.

    [5]BRAUN V,DESCHAMPS C,RAPOSO G,et al.AP-1 and ARF1 control endosomal dynamics at sites of FcR mediated phagocytosis[J].Mol Biol Cell,2007,18(12):4921-4931.

    [6]JOSHI A,GARG H,NAGASHIMA K,et al.GGA and ARF protein modulate Retrovirus assembly and release [J].Mol Cell,2008,30(2):227-238.

    [7]GARCíA-EXPóSITO L,BARROSO-GONZáLEZ J,PUIGDOMèN ECH I,et al.HIV-1 requires Arf6-mediated membrane dynamics to efficiently enter and infect T lymphocytes [J].Mol Biol Cell,2011,22(8):1148-1166.

    [8]DONALDSON J G,HONDA A.Localization and function of Arf family GTPase [J].Biochem Soc Trans,2005,33(4):639-642.

    [9]HAMMONDS-ODIE L P,JACKSON T R,PROFIT A A,et al.I-dentification and cloning of centaurin-α a novel phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate-binding protein from rat brain [J].J Biol Chem,1996,271(31):18859-18868.

    [10]HAYASHI H,MATSUZAKI O,MURAMATSU S,et al.Centaurin-α1 Is a Phosphatidylinositol 3-Kinase-dependent activator of ERK1/2 mitogen-activated protein kinases [J].J Biol Chem,2006,281(3):1332-1337.

    [11]LAWRENCE J,MUNDELL S J,YUN H R,et al.Centaurin-α1,an ADP-ribosylation factor 6 GTPase activating protein,inhibits β2-adrenoceptor internalization [J].Mol Pharmacol,2005,67(6):1822-1828.

    [12]WANG H F,MA J Y,RUAN L W,et al.Cloning of a centaurina1 like gene MjCent involved in WSSV infection from shrimp Marsupeneaus japonicus [J].Fish Shellfish Immunol,2009,26(2):279-284.

    [13]EHRHARDT C,MARJUKI H,WOLFF T,et al.Bivalent role of the phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)during influenza virus infection and host cell defence [J].Cell Microbiol,2006,8(8):1336-1348.

    猜你喜歡
    融合
    一次函數“四融合”
    兩個壓縮體融合為一個壓縮體的充分必要條件
    村企黨建聯建融合共贏
    融合菜
    寬窄融合便攜箱TPFS500
    寬窄融合便攜箱IPFS500
    從創(chuàng)新出發(fā),與高考數列相遇、融合
    寬窄融合便攜箱IPFS500
    《融合》
    現代出版(2020年3期)2020-06-20 07:10:34
    “四心融合”架起頤養(yǎng)“幸福橋”
    福利中國(2015年4期)2015-01-03 08:03:38
    亚洲精品国产成人久久av| .国产精品久久| 99热6这里只有精品| 国产成年人精品一区二区| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩三级伦理在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久a久久爽久久v久久| 性色avwww在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久久久黄片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费av观看视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 水蜜桃什么品种好| 久久久国产一区二区| 久久国产乱子免费精品| 中文资源天堂在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人91sexporn| 亚洲av二区三区四区| 精品久久久久久成人av| 69人妻影院| 久久国产乱子免费精品| 国产精品一区二区在线观看99 | 大香蕉97超碰在线| av免费在线看不卡| 亚洲电影在线观看av| 99久久人妻综合| videossex国产| 七月丁香在线播放| 两个人的视频大全免费| 亚洲图色成人| 一区二区三区四区激情视频| 草草在线视频免费看| 国产毛片a区久久久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美激情在线99| 黄片wwwwww| 国产老妇女一区| 亚洲三级黄色毛片| 男人爽女人下面视频在线观看| av免费观看日本| 成人亚洲欧美一区二区av| 日日啪夜夜爽| 简卡轻食公司| 男女国产视频网站| 亚洲真实伦在线观看| 高清视频免费观看一区二区 | 国产精品久久久久久久久免| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久久伊人网av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产日韩欧美在线精品| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久a久久爽久久v久久| av国产久精品久网站免费入址| 最新中文字幕久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产高清有码在线观看视频| eeuss影院久久| 三级经典国产精品| 高清在线视频一区二区三区| 一本一本综合久久| 嫩草影院精品99| 免费看a级黄色片| 人人妻人人看人人澡| 好男人视频免费观看在线| 亚洲美女视频黄频| 熟女电影av网| 秋霞伦理黄片| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 七月丁香在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 少妇高潮的动态图| 久久久久久久国产电影| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 久久久亚洲精品成人影院| 国产探花极品一区二区| 又爽又黄a免费视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品久久久久久精品电影| 免费观看av网站的网址| 看黄色毛片网站| 极品教师在线视频| 久久久久九九精品影院| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品久久久久久av不卡| 99久久精品热视频| 天堂中文最新版在线下载 | 午夜视频国产福利| 免费看av在线观看网站| 高清欧美精品videossex| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久久久大尺度免费视频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产欧美人成| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产三级在线视频| 可以在线观看毛片的网站| 成年人午夜在线观看视频 | 又大又黄又爽视频免费| 不卡视频在线观看欧美| 免费少妇av软件| 日韩一区二区三区影片| 一本一本综合久久| 毛片一级片免费看久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一个人看的www免费观看视频| 联通29元200g的流量卡| 99久久人妻综合| 久久人人爽人人片av| 能在线免费看毛片的网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人精品福利久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久99久视频精品免费| 久99久视频精品免费| 国产成人aa在线观看| 国产精品一区www在线观看| 五月天丁香电影| 熟女人妻精品中文字幕| 99热6这里只有精品| 超碰97精品在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲三级黄色毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产成人a区在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 成人亚洲精品av一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 国产91av在线免费观看| 中文字幕制服av| 亚洲精品456在线播放app| 久久精品久久久久久久性| 亚洲国产精品成人久久小说| 国内精品宾馆在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久国内精品自在自线图片| 97热精品久久久久久| 免费观看无遮挡的男女| 午夜亚洲福利在线播放| 日本av手机在线免费观看| 久久久精品94久久精品| 欧美精品国产亚洲| 色综合亚洲欧美另类图片| 一级毛片 在线播放| 七月丁香在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 美女国产视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 日本wwww免费看| 七月丁香在线播放| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 美女黄网站色视频| 97超视频在线观看视频| 在线免费观看的www视频| 七月丁香在线播放| 久久这里只有精品中国| 日韩三级伦理在线观看| 床上黄色一级片| 男女国产视频网站| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久精品欧美日韩精品| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 婷婷色综合www| 久久人人爽人人片av| 久久久久久久国产电影| 国产高清三级在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久免费精品人妻一区二区| av在线亚洲专区| 大陆偷拍与自拍| 欧美xxⅹ黑人| freevideosex欧美| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲欧洲国产日韩| 国产av不卡久久| 深爱激情五月婷婷| 欧美zozozo另类| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 免费看美女性在线毛片视频| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜福利在线观看吧| 欧美xxxx性猛交bbbb| av线在线观看网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产探花极品一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品自拍成人| 看非洲黑人一级黄片| 日韩欧美三级三区| 午夜亚洲福利在线播放| 天美传媒精品一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 精品人妻熟女av久视频| 91精品国产九色| 日日啪夜夜爽| av专区在线播放| 高清视频免费观看一区二区 | 国产永久视频网站| 成人二区视频| 天天一区二区日本电影三级| 成人午夜高清在线视频| 九九在线视频观看精品| 在线a可以看的网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 日日啪夜夜撸| av又黄又爽大尺度在线免费看| 超碰av人人做人人爽久久| 春色校园在线视频观看| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲丝袜综合中文字幕| 女人久久www免费人成看片| 亚洲人与动物交配视频| 三级国产精品片| 日本三级黄在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 乱人视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 91狼人影院| av网站免费在线观看视频 | 中国国产av一级| 好男人视频免费观看在线| 国产69精品久久久久777片| 国产日韩欧美在线精品| 黄色配什么色好看| 日日啪夜夜撸| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久性生活片| 亚洲在线观看片| 国产精品1区2区在线观看.| av播播在线观看一区| 一级a做视频免费观看| 午夜福利在线观看吧| 女人被狂操c到高潮| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 熟女电影av网| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 免费看美女性在线毛片视频| 国产中年淑女户外野战色| 天堂影院成人在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 高清在线视频一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 天堂中文最新版在线下载 | 十八禁国产超污无遮挡网站| 十八禁网站网址无遮挡 | 色网站视频免费| 免费高清在线观看视频在线观看| 精品久久久久久久久av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久精品国产亚洲网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲av成人av| 最后的刺客免费高清国语| 特大巨黑吊av在线直播| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品一区二区性色av| 美女国产视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲精品第二区| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩一本色道免费dvd| 久久久成人免费电影| 久久99热这里只频精品6学生| 久久精品国产亚洲网站| 中文字幕av在线有码专区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品一及| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 乱系列少妇在线播放| 天堂网av新在线| 永久网站在线| av免费在线看不卡| 精品久久久精品久久久| 日韩一区二区三区影片| 免费av观看视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品一区在线观看国产| 午夜爱爱视频在线播放| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲伊人久久精品综合| 好男人视频免费观看在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产av在哪里看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美潮喷喷水| 亚洲四区av| 久久久久久久国产电影| 岛国毛片在线播放| 精品国产三级普通话版| 好男人视频免费观看在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 91精品国产九色| 国产精品.久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 能在线免费看毛片的网站| 日韩欧美国产在线观看| 国产成人精品福利久久| 久久99热这里只有精品18| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99热6这里只有精品| 国产午夜精品论理片| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美激情国产日韩精品一区| 色综合亚洲欧美另类图片| 一区二区三区免费毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 不卡视频在线观看欧美| 日韩伦理黄色片| 好男人视频免费观看在线| 丝袜喷水一区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 夫妻午夜视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美+日韩+精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 美女内射精品一级片tv| 真实男女啪啪啪动态图| av在线蜜桃| 激情 狠狠 欧美| 青春草国产在线视频| 国产成人freesex在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品久久久久久av不卡| 国产在线一区二区三区精| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲内射少妇av| 韩国av在线不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| av国产免费在线观看| 六月丁香七月| 国产色婷婷99| 22中文网久久字幕| 丰满乱子伦码专区| 国产乱来视频区| 国产成人精品福利久久| 我的女老师完整版在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产一区有黄有色的免费视频 | 91av网一区二区| 国精品久久久久久国模美| 亚洲久久久久久中文字幕| 在线a可以看的网站| xxx大片免费视频| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲在久久综合| 一级毛片 在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 国产伦在线观看视频一区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国内精品宾馆在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 深夜a级毛片| 午夜老司机福利剧场| 成人欧美大片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久韩国三级中文字幕| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美zozozo另类| 夜夜爽夜夜爽视频| 免费看a级黄色片| 精品久久久久久久末码| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费观看a级毛片全部| 成人无遮挡网站| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩av在线大香蕉| 日韩视频在线欧美| 人人妻人人澡欧美一区二区| 六月丁香七月| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品国产av成人精品| 中文字幕av在线有码专区| 成人国产麻豆网| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲精品一二三| 亚洲av男天堂| 午夜激情福利司机影院| av天堂中文字幕网| 淫秽高清视频在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 中文天堂在线官网| 两个人视频免费观看高清| 中文字幕久久专区| 美女主播在线视频| av女优亚洲男人天堂| 人妻一区二区av| 美女黄网站色视频| 青春草国产在线视频| 波多野结衣巨乳人妻| 精品熟女少妇av免费看| 舔av片在线| 午夜精品国产一区二区电影 | 中文在线观看免费www的网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产免费又黄又爽又色| 日本色播在线视频| 久久久久网色| 少妇高潮的动态图| 国产亚洲最大av| 国产v大片淫在线免费观看| 日本黄大片高清| 一夜夜www| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 日本午夜av视频| 在线 av 中文字幕| 亚洲在久久综合| 国产男人的电影天堂91| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产免费福利视频在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久色成人| 女人久久www免费人成看片| 淫秽高清视频在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国国产精品蜜臀av免费| 日韩欧美国产在线观看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲精品日本国产第一区| 看十八女毛片水多多多| 91久久精品国产一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 男女边吃奶边做爰视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久午夜欧美精品| 国产亚洲精品久久久com| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 欧美另类一区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩精品青青久久久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 91狼人影院| 一级片'在线观看视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩av不卡免费在线播放| 美女cb高潮喷水在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 中国国产av一级| 成人综合一区亚洲| 久久久久久久久大av| 嘟嘟电影网在线观看| 午夜日本视频在线| 老司机影院成人| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久久久国产a免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品无大码| 久久人人爽人人片av| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲精品一二三| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 2022亚洲国产成人精品| 老司机影院成人| 欧美最新免费一区二区三区| 综合色丁香网| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久久久久大av| 国产精品久久久久久久久免| 午夜福利在线在线| 在线免费十八禁| 插逼视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美+日韩+精品| 91久久精品国产一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 久久久久久久国产电影| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 天天一区二区日本电影三级| 成人漫画全彩无遮挡| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人精品婷婷| 久久久久久久亚洲中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 欧美成人午夜免费资源| 日本色播在线视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产乱人视频| 国产精品一区www在线观看| 天堂中文最新版在线下载 | 在线观看一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 韩国av在线不卡| 男女边摸边吃奶| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 在现免费观看毛片| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品.久久久| 欧美激情在线99| 久久久久国产网址| 免费观看性生交大片5| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久久久久中文| 激情五月婷婷亚洲| 成人午夜精彩视频在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产av不卡久久| 日韩电影二区| 精品久久久久久久久av| 免费人成在线观看视频色| 一边亲一边摸免费视频| 免费人成在线观看视频色| av又黄又爽大尺度在线免费看| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成人美女网站在线观看视频| 黑人高潮一二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人精品一,二区| 七月丁香在线播放| 国产大屁股一区二区在线视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 乱码一卡2卡4卡精品| 一级毛片 在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品一及| 日韩视频在线欧美| 国产精品三级大全| 国产精品不卡视频一区二区| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩国内少妇激情av| 国产免费视频播放在线视频 | 国产综合精华液| 国产毛片a区久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| h日本视频在线播放| 性色avwww在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品一区www在线观看| 国产永久视频网站| 一级黄片播放器| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久伊人网av| 国产免费又黄又爽又色| 国国产精品蜜臀av免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 69人妻影院| 精品国产露脸久久av麻豆 | 尤物成人国产欧美一区二区三区|