油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈抗性的生理應(yīng)答

陳宏州， 楊敬輝， 張文文， 陳 露， 莊義慶

(江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400)

在中國(guó)，冬油菜約占油菜總種植面積的90%， 主要分布于長(zhǎng)江流域，且多為稻茬油菜田，這就導(dǎo)致了喜濕性禾本科雜草——日本看麥娘(Alopecurus japonicus)危害嚴(yán)重而又難以防除［1］。目前，油菜田日本看麥娘仍以化學(xué)防治為主，防除藥劑主要為芳氧基苯氧丙酸(Aryloxyphenoxypropionate，AOPP)類和環(huán)已烯酮(Cyclohexanedione，CHD)類除草劑，其中AOPP類除草劑——高效氟吡甲禾靈(Haloxyfop-R-methyl)為主導(dǎo)藥劑［1］。近年來，油菜田日本看麥娘發(fā)生比重不斷上升，危害日益嚴(yán)重，農(nóng)民為了達(dá)到防除雜草的目的，不斷增加施藥量和施藥次數(shù)，使除草劑對(duì)雜草的選擇壓逐年上升。由于AOPP類和CHD類除草劑作用靶標(biāo)單一，長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)單一使用，導(dǎo)致防效下降，甚至有產(chǎn)生明顯抗性的報(bào)道。楊彩宏等［2］、潘以樓等［3］報(bào)道油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生了明顯的抗藥性，且抗性程度與用藥年限的長(zhǎng)短有一定的關(guān)系。陳宏州等［4］報(bào)道在江蘇省句容市部分油菜田，10.8%高效氟吡甲禾靈EC按推薦劑量的3倍使用，1次用藥后60 d，對(duì)日本看麥娘的株防效為負(fù)值。

AOPP類和CHD類除草劑作用靶標(biāo)都是乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase，ACCase)。研究人員發(fā)現(xiàn)雜草體內(nèi)ACCase被修飾使雜草對(duì)多數(shù)AOPP類和CHD類除草劑的敏感性降低，從而產(chǎn)生抗藥性，而這種抗性多為單個(gè)基因控制［5-6］。這種抗藥性機(jī)制已在澳大利亞的抗性早熟禾、羊茅屬雜草和瑞士黑麥草中得到證實(shí)［7］。中國(guó)在雜草抗藥性方面的研究，與國(guó)外相比相對(duì)滯后，且多數(shù)集中于抗性雜草的鑒定方法上。近年來，為了延緩抗性的發(fā)展，越來越多的研究人員開始更加注重抗性產(chǎn)生的分子機(jī)理以及生理機(jī)制研究。黃世霞等［8］采用雙向等位基因特異性PCR研究不同抗性生物型看麥娘對(duì)ACCase抑制劑類除草劑稀禾啶和高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生交互抗性的分子基礎(chǔ)，證實(shí)了靶標(biāo)酶ACCase可能存在多個(gè)突變位點(diǎn)而產(chǎn)生不同模式的抗藥性，同時(shí)也表明AOPP類和CHD類除草劑的作用位點(diǎn)是有差異的。韓瑞娟等［9］研究了抗性和敏感日本看麥娘體內(nèi)細(xì)胞色素P450還原酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性差異，結(jié)果表明代謝酶活性增強(qiáng)是日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗性的機(jī)理之一。

目前，關(guān)于油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗性的生理機(jī)制還鮮有報(bào)道。本研究以種子生物測(cè)定法鑒定了3個(gè)油菜田日本看麥娘種群對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗性水平，然后進(jìn)行不同抗性生物型日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后在生理水平上的應(yīng)答研究，以期為抗性日本看麥娘的防除與治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試種子

2011年5月，在高效氟吡甲禾靈使用15～20年的江蘇省句容市和丹陽(yáng)市油菜田采集成熟的日本看麥娘種子，獲取2個(gè)日本看麥娘種群，分別命名為JR種群和DY種群［10］。野生日本看麥娘種群(CZ種群)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院董立堯教授提供，該種群采自安徽滁州休閑田［2］。

1.2 供試藥劑

94.9%高效氟吡甲禾靈原藥(江蘇揚(yáng)農(nóng)化工有限公司)，用適量二甲苯溶解后，加入10%的吐溫－80，配制成10 000 μg/ml的母液置于4℃冰箱中備用;10.8%高效氟吡甲禾靈EC為美國(guó)陶氏益農(nóng)公司產(chǎn)品。

1.3 日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗性水平檢測(cè)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以種子生物測(cè)定法［11］，將50粒經(jīng)預(yù)先催芽且芽長(zhǎng)約1 mm的日本看麥娘種子放在鋪有一層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入5 ml濃度分 別 為 0 μg/ml、80.000 00 μg/ml、40.000 00 μg/ml、 20.000 00 μg/ml、 10.000 00 μg/ml、5.000 00 μg/ml、2.500 00 μg/ml、1.250 00 μg/ml、0.625 00 μg/ml、0.312 50 μg/ml和0.156 25 μg/ml的高效氟吡甲禾靈藥液，加蓋確保種子處于濕潤(rùn)狀態(tài)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(光照/黑暗為12 h/12 h;溫度:白天18℃，晚上15℃)，每處理重復(fù)4次。藥劑處理10 d后，測(cè)量芽長(zhǎng)，計(jì)算藥劑對(duì)雜草種子芽長(zhǎng)的抑制率。

采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，計(jì)算藥劑對(duì)不同日本看麥娘種群的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)、EC50及其95%置信限，并計(jì)算相對(duì)抗性倍數(shù)。相對(duì)抗性倍數(shù)=不同地區(qū)日本看麥娘種群的EC50/敏感日本看麥娘種群的EC50［3］。

1.4 不同抗性生物型的生理指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 材料準(zhǔn)備 將壤質(zhì)菜園土與沙按3∶1混勻后，裝入直徑為9 cm的塑料盆缽內(nèi)，然后將適量不同抗性生物型的日本看麥娘種子分別播種于盆缽內(nèi)，并置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同方法1.3，出苗后每盆定苗30株。日本看麥娘長(zhǎng)至3～4葉期后，用10.8%高效氟吡甲禾靈EC以400 ml/hm2進(jìn)行莖葉噴霧處理，以清水處理為對(duì)照，各處理重復(fù)4次。以敏感種群受藥劑脅迫約7 d后開始出現(xiàn)明顯的受害癥狀為依據(jù)，分別于處理后0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d采集各處理植株的葉片，取樣后立即測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.4.2 生理指標(biāo)測(cè)定 分別測(cè)定各樣品的葉綠素(Chl.)、類胡蘿卜素(Car.)、可溶性糖和丙二醛(MDA)的含量以及過氧化物酶(POD)活性。測(cè)定方法參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》［12］，其中可溶性糖含量用苯酚法測(cè)定;POD活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理并作圖;用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，最小顯著法(LSD)檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 抗性水平檢測(cè)結(jié)果

抗性水平檢測(cè)結(jié)果(表1)表明，高效氟吡甲禾靈對(duì)JR、DY和CZ種群日本看麥娘種子胚芽生長(zhǎng)抑制的 EC50分別為5.796 3 μg/ml、0.425 2 μg/ml和0.067 9 μg/ml。以采自安徽滁州未用藥的日本看麥娘種群(CZ種群)對(duì)高效氟吡甲禾靈的敏感性作為敏感基線得出，JR和DY種群的相對(duì)抗性倍數(shù)分別為85.36和6.26。即JR種群為高抗生物型，DY種群為低抗生物型。

表1 不同日本看麥娘種群對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗性水平檢測(cè)Table 1 Resistance levels of different Alopecurus japonicus populations to haloxyfop-R-methyl

2.2 日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片光合色素含量

從表2可以看出，JR種群日本看麥娘，在藥劑脅迫后的第 0 d、1 d、2 d、3 d、5 d 和 7 d，葉綠素 a(Chl.a)、葉綠素 b(Chl.b)和總?cè)~綠素(Chl.)含量略有下降，而對(duì)照均略有上升;類胡蘿卜素(Car.)含量和 Chl.a/Chl.b比值與對(duì)照一樣略有上升;Car./Chl.比值略有上升趨勢(shì)，對(duì)照則基本穩(wěn)定。DY種群和CZ種群日本看麥娘，在藥劑脅迫后，Chl.a、Chl.b、Chl.和 Car.含量均顯著下降，而對(duì)照略有上升。CZ種群日本看麥娘，在藥劑脅迫后第 7 d，Chl.a、Chl.b、Chl.和Car.含量分別為對(duì)照的 31.52%、40.83%、34.00%和23.97%，下降最顯著。DY種群和CZ種群日本看麥娘，Chl.a/Chl.b比值均有下降，CZ種群下降較明顯，而對(duì)照略有上升。DY種群日本看麥娘 Car./Chl.比值略有上升，對(duì)照基本穩(wěn)定。CZ種群日本看麥娘 Car./Chl.比值下降顯著，對(duì)照基本穩(wěn)定。

表2 不同抗性生物型日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片光合色素的含量Table 2 Photosynthetic pigments contents in the leaves of Alopecurus japonicus with different resistances after haloxyfop-R-methyl spraying

2.3 日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片可溶性糖含量

從圖1可以看出，不同抗性生物型日本看麥娘在噴施高效氟吡甲禾靈后，葉片可溶性糖含量均有上升趨勢(shì)，其中高抗生物型略有上升，敏感和低抗生物型上升較為顯著。JR種群可溶性糖含量增加相對(duì)較少，藥劑脅迫后第7 d，可溶性糖含量為其對(duì)照的1.5倍;DY種群在藥劑脅迫后第7 d，可溶性糖含量為其對(duì)照的2.3倍;CZ種群可溶性糖含量增加最顯著，藥劑脅迫后第7 d，可溶性糖含量為其對(duì)照的3倍。

圖1 不同抗性生物型日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片可溶性糖含量Fig.1 Soluble sugar contents in the leaves of Alopecurus japonicus with different resistances after haloxyfop-R-methy spraying

2.4 日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片MDA含量

從圖2可以看出，不同抗性生物型日本看麥娘在噴施高效氟吡甲禾靈后，葉片MDA含量變化差異顯著。JR種群在藥劑脅迫后7 d內(nèi)，葉片MDA含量與其對(duì)照差異不顯著。DY種群在藥劑脅迫后第3 d，葉片MDA含量開始呈上升趨勢(shì)，藥劑脅迫后第7 d，葉片MDA含量為其對(duì)照的2.2倍。CZ種群在藥劑脅迫后，葉片MDA含量呈上升趨勢(shì)，藥劑脅迫后第7 d，葉片MDA含量為其對(duì)照的4倍。

圖2 不同抗性生物型日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片MDA含量Fig.2 MDA contents in the leaves of Alopecurus japonicus with different resistances after haloxyfop-R-methyl spraying

2.5 日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片POD活性

從圖3可以看出，不同抗性生物型日本看麥娘在噴施高效氟吡甲禾靈后，葉片POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中高抗生物型變化平緩，而低抗和敏感生物型則反應(yīng)強(qiáng)烈。JR種群在藥劑脅迫后第5 d，葉片POD活性為其對(duì)照的1.7倍，第7 d降至其對(duì)照的1.4倍。DY種群在藥劑脅迫后5 d內(nèi)，葉片POD活性有明顯上升趨勢(shì)，第5 d時(shí)為其對(duì)照的3倍，第7 d時(shí)葉片又降至對(duì)照的1.5倍。CZ種群在藥劑脅迫后5 d內(nèi)，葉片POD活性上升最顯著，第5 d時(shí)為其對(duì)照的3.7倍，第7 d時(shí)又降至對(duì)照的2.2倍。這表明，高抗生物型日本看麥娘受高效氟吡甲禾靈的影響較小，表現(xiàn)出一定的生理適應(yīng)性。

圖3 不同抗性生物型日本看麥娘噴施高效氟吡甲禾靈后葉片POD的活性Fig.3 POD activities in the leaves of Alopecurus japonicus with different resistances after haloxyfop-R-methyl spraying

3 討論

由于過度依賴和長(zhǎng)期使用相對(duì)有限的化學(xué)除草劑，導(dǎo)致了雜草抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，且雜草抗藥性問題越來越突出，備受全球關(guān)注。抗藥性檢測(cè)是抗性雜草治理的重要環(huán)節(jié)，其研究方法不斷發(fā)展并日漸重要［13］。目前，雜草抗藥性檢測(cè)的方法主要有種子生物測(cè)定法、整株測(cè)定法、幼苗實(shí)驗(yàn)法、分蘗法、花粉粒檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)法、PCR 檢測(cè)法等［14-16］。種子生物測(cè)定法，只需觀察種子發(fā)芽趨勢(shì)就可準(zhǔn)確判斷是否發(fā)生抗藥性，具有快速、簡(jiǎn)便易行、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、占用空間小、適用于大面積種子的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因而在抗藥性檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。本研究利用種子生物測(cè)定法檢測(cè)了不同油菜田日本看麥娘種群對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗藥性，結(jié)果表明采自江蘇省句容市的JR種群日本看麥娘為高抗生物型，這與前人的研究結(jié)果一致［2-3］，而采自江蘇省丹陽(yáng)市的 DY種群為低抗生物型。

在噴施高效氟吡甲禾靈后，低抗和敏感生物型油菜田日本看麥娘葉片的 Chl.a、Chl.b、Chl.和 Car.含量有明顯下降，光合色素構(gòu)成發(fā)生變化，葉片可溶性糖和MDA含量上升顯著，POD活性先上升后下降并且反應(yīng)強(qiáng)烈。這表明，低抗和敏感生物型日本看麥娘植株體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)受到損害，清除活性氧及過氧化物自由基，能力大幅下降，細(xì)胞質(zhì)膜受損嚴(yán)重，其中敏感生物型比低抗生物型受藥劑的影響更為明顯。高抗生物型日本看麥娘，通過增加滲透調(diào)節(jié)劑可溶性糖含量，來保護(hù)原生質(zhì)與環(huán)境之間的滲透平衡和結(jié)構(gòu)的完整性，增加POD活性來清除活性氧及過氧化物自由基，從而降低了藥劑脅迫下葉片膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的生成量。這表明，高抗生物型日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈具有一定的生理適應(yīng)性。

致謝: 感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院董立堯教授為本研究提供了油菜田野生日本看麥娘種子!

［1］強(qiáng) 勝.雜草學(xué)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［2］楊彩宏，董立堯，李 俊，等.油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈抗藥性的研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(12):2759-2765.

［3］潘以樓，朱桂梅，楊敬輝.日本看麥娘對(duì)芳基苯氧基丙酸類除草劑的耐性［J］.雜草科學(xué)，2007(3):19-21.

［4］陳宏州，朱桂梅，楊敬輝，等.烯草酮與高效氟吡甲禾靈對(duì)日本看麥娘的毒力及田間防效［J］.雜草科學(xué)，2009(3):25-27.

［5］MARLES M A，DEVINE M D，HALL J C.Herbicide resistance in Setaria viridis conferred by a less sensitive form of acetyl-CoA carboxylase［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，1993，46(1):7-14.

［6］DEVINE M D.Mechanisms of resistance to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitors:a review［J］.Pesticide Science，1997，51(3):259-264.

［7］PRESTON C，TARDIF F J，CHRISTOPHER J T，et a1.Multiple resistance to dissimilar herbicide chemistries in a biotype of Lolium rigidum due to enhanced activity of several herbicide degrading enzymes［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，1996，54(2):123-134.

［8］黃世霞，何金鈴，王慶亞，等.看麥娘對(duì)稀禾啶和高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗藥性的分子基礎(chǔ)［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2010(6):832-837.

［9］韓瑞娟，董立堯，李 俊，等.日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈代謝抗性的初步研究［J］.雜草科學(xué)，2010(1):3-7.

［10］陳宏州，楊敬輝，朱桂梅，等.油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗藥性檢測(cè)［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25(2):502-506.

［11］TAL A，KOTOUIL-SYKA E，RUBIN B.Seed-bioassay to detect grass weeds resistant to acetyl coenzyme acarboxylase inhibiting herbicides［J］.Crop Protection，2000，19:467-472.

［12］李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［13］張朝賢，倪漢文，魏守輝，等.雜草抗藥性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(4):1274-1289.

［14］LETOUZE A，GASQUEZ J.A rapid reliable test for screening aryloxyphenoxypropionic acid resistance within Alopecurus myosuroides and Lolium spp.populations［J］.Weed Research，1999，39(1):37-48.

［15］LETOUZE A，GASQUEZ J.A pollen test to detect ACCase targetsite resistance within Alopecurus myosuroides populations［J］.Weed Research，2000，40(2):151-162.

［16］LETOUZE A，GASQUEZ J.Inheritance of fenoxaprop-P-ethyl resistance in a blackgrass(Alopecurus myosuroides Huds.)population［J］.Theoretical＆ Applied Genetics，2001，103(2/3):288-296.