Cry1Ac毒蛋白質(zhì)對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)幾種酶活性的影響

周 瓊， 黃東林， 祁靜霞， 吳海燕， 楊麗芬，2， 施敏娟，3， 楊益眾

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇揚(yáng)農(nóng)化工集團(tuán)有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225009;3.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001)

亞洲玉米螟［Ostrinia furnacalis(Güenée)］是中國(guó)玉米生產(chǎn)上最重要的害蟲(chóng)，上世紀(jì)70年代以來(lái)對(duì)棉花的為害逐年加重［1-3］，成為長(zhǎng)江中下游和黃河流域玉米、棉花混作區(qū)為害棉花的重要鉆蛀性害蟲(chóng)［4］。轉(zhuǎn)基因棉花的大面積推廣也成為控制亞洲玉米螟為害的重要手段［5］。但Bt作物的持續(xù)大面積種植，使多化性害蟲(chóng)連續(xù)暴露在Bt毒蛋白質(zhì)的作用下，增加了選擇壓，耐受性的群體得到發(fā)展，以致在群體水平上產(chǎn)生害蟲(chóng)抗性［6］。研究結(jié)果表明，許多害蟲(chóng)對(duì)Bt均能產(chǎn)生抗性［7-8］。但抗性的機(jī)理仍在不斷探討過(guò)程中。

解毒酶和保護(hù)酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)的主要酶系，乙酰膽堿酯酶是神經(jīng)突觸部位清除乙酰膽堿、維護(hù)神經(jīng)正常傳導(dǎo)的重要酶類(lèi)，其活性是衡量昆蟲(chóng)神經(jīng)生理活性的主要指標(biāo)［9］。而許多殺蟲(chóng)劑是以乙酰膽堿酯酶為靶標(biāo)，因此該酶與昆蟲(chóng)的解毒作用有密切的關(guān)系。昆蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶系主要有氧化酶、還原酶、水解酶3種代表性酶類(lèi)和轉(zhuǎn)移酶4類(lèi)，而水解酶中的酯酶和轉(zhuǎn)移酶類(lèi)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶對(duì)分解外源毒物，維持正常的生理代謝起到很重要的作用［10］。已有研究證實(shí)，昆蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶活性受到Bt毒蛋白質(zhì)的影響而發(fā)生變化，可能與蟲(chóng)體對(duì)毒蛋白質(zhì)的代謝及抗性產(chǎn)生有關(guān)［11-12］。而超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)則是普遍存在于生物體內(nèi)的2種重要的防御氧化損傷的保護(hù)酶。SOD的作用是把O2·－歧化成 H2O2，H2O2能與 O2·－形成毒性更強(qiáng)的氫氧自由基(HO·)，但細(xì)胞內(nèi)的CAT可以將H2O2轉(zhuǎn)化成水，生物體內(nèi)的幾種保護(hù)酶處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個(gè)低水平，起到保護(hù)生物機(jī)體的作用［13］。因此，研究Bt毒蛋白質(zhì)與亞洲玉米螟體內(nèi)相關(guān)酶活的關(guān)系，不但可以了解Bt轉(zhuǎn)基因棉對(duì)亞洲玉米螟的毒性作用，還可以探尋該害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的可能性，也為更好地利用轉(zhuǎn)基因棉控制玉米螟提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源 亞洲玉米螟來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)玉米田。第一代室內(nèi)試驗(yàn)用采集于玉米上的卵;第二、三代試驗(yàn)蟲(chóng)源分別來(lái)自田間捕捉的上代成蟲(chóng)，在室內(nèi)常溫條件下，放置于高10 cm直徑7 cm的罐頭瓶?jī)?nèi)飼喂，瓶?jī)?nèi)壁覆以蠟紙，頂部用窗網(wǎng)封住，并用牛皮筋扎緊，每天早中晚3次用蘸有10%蜜糖水的脫脂棉放在窗網(wǎng)上供成蟲(chóng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，產(chǎn)卵后用于試驗(yàn)。

1.1.2 Cry1Ac毒蛋白質(zhì)及人工飼料的配制 20%Cry1Ac毒蛋白質(zhì)粉劑由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。分別稱(chēng)取20%Cry1Ac毒蛋白質(zhì)粉劑0.005 350 g、0.013 375 g、0.021 400 g 和0.029 425 g，用50 mmol/L Na2CO3溶液溶解并用蒸餾水定容至100 ml，置4℃冰箱保存。人工飼料的配制參照周大榮等［14］的方法加以改進(jìn)，待配好的飼料冷卻至60℃左右，加入10 ml溶解好的Cry1Ac蛋白質(zhì)，充分混勻，配制成 200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g、1 100 ng/g及對(duì)照(不加Cry1Ac蛋白質(zhì))5種不同Cry1Ac含量的人工飼料，冷卻后置4℃冰箱保存。

1.1.3 幼蟲(chóng)飼喂和樣本收集 亞洲玉米螟初孵幼蟲(chóng)分別飼喂在裝有不同Cry1Ac含量人工飼料的高10 cm直徑7 cm的罐頭瓶?jī)?nèi)。收集生長(zhǎng)整齊的3齡幼蟲(chóng)13頭及5齡幼蟲(chóng)3頭放入離心管中，重復(fù)3次。以上供試幼蟲(chóng)均放在－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試驗(yàn)條件 試驗(yàn)于溫度 29℃ ±1℃、相對(duì)濕度 85% ±5%、光周期16∶8(L∶D)的光照箱(RXZ智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn))內(nèi)進(jìn)行。

1.1.5 主要供試藥劑及試劑盒 碘化硫代乙酰膽堿(ACTHI)、5，5-二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)、毒扁豆堿、α-乙酸萘酯、α-萘酚、固藍(lán)B鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、丙酮、無(wú)水乙醇、GSH-ST試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒。

1.2 乙酰膽堿酯酶及解毒酶測(cè)定方法與操作步驟

1.2.1 酶源的制備 將試蟲(chóng)樣品導(dǎo)入勻漿器中，加入1 ml pH 7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液(含0.1%TritonX-100)，冰浴勻漿。勻漿液在4℃下10 000 g離心15 min，取上清液作為酶源。每個(gè)處理重復(fù)3次，在酶標(biāo)儀下(Power wave XS酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-TeK公司產(chǎn)品)分析酶活性。

1.2.2 乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測(cè)定 參照Ellman等［15］的方法并加以改進(jìn)。于412 nm下測(cè)OD值，掃描20 min，1 min讀1次數(shù)，計(jì)算AchE活性。

1.2.3 α-乙酸萘酯酶活性測(cè)定 參照 Van［16］的方法并加以改進(jìn)。室溫下放置10 min，于600 nm處比色，測(cè)OD值。以α-萘酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 羧酸酯酶(CarE)活性測(cè)定 參照Van［16］的方法并加以改進(jìn)。室溫下放置10 min，于600 nm處比色，測(cè)OD值。

1.2.5 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性測(cè)定 按GST測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 保護(hù)酶測(cè)定方法與操作步驟

1.3.1 酶源的制備 將試蟲(chóng)樣品導(dǎo)入勻漿器中，以生理鹽水作介質(zhì)，加入1 ml 67.25%的生理鹽水，冰浴勻漿，勻漿液在4℃下10 000 g離心15 min。取上清液作為酶源。每個(gè)處理重復(fù)3次，在酶標(biāo)儀下分析酶活性。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定 按總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定 按過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定，以牛血清蛋白質(zhì)(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。操作步驟按Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用DPS軟件中單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的Tukey氏固定極差測(cè)驗(yàn)法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cry1Ac毒蛋白質(zhì)對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響

表1表明，不同含量Cry1Ac人工飼料對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)乙酰膽堿酯酶活性有顯著影響(3齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=16.05，P＜0.05;5 齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=4.19，P＜0.05)。乙酰膽堿酯酶的活性除200 ng/g毒蛋白質(zhì)的處理外均高于對(duì)照，且隨著毒蛋白質(zhì)含量的升高而上升。1 100 ng/g處理的3齡幼蟲(chóng)該酶的活性分別比800 ng/g、500 ng/g、200 ng/g的處理及對(duì)照顯著升高了 11.19%、17.03%、23.28%、19.85%，800 ng/g處理的酶活性比200 ng/g的處理顯著升高了10.88%。1 100 ng/g處理的5齡幼蟲(chóng)酶活性比200 ng/g的處理顯著升高19.24%。

表1 取食不同含量Cry1Ac人工飼料的亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性變化Table 1 Changes in the activitiy ofacetylcholinesterase in Ostrinia furnacalis larvae feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

2.2 Cry1Ac蛋白質(zhì)對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性的影響

如圖1所示，亞洲玉米螟取食不同含量Cry1Ac毒蛋白質(zhì)的人工飼料后，對(duì)α-乙酸萘酯酶活性影響顯著(3齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=107.58，P＜0.05;5齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=26.61，P ＜0.05)。200 ng/g Cry1Ac毒蛋白質(zhì)處理時(shí)，3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶活性與對(duì)照相比有所上升，隨著毒蛋白質(zhì)含量的升高，α-乙酸萘酯酶活性逐漸被抑制;500 ng/g處理時(shí)α-乙酸萘酯酶活性比200 ng/g處理時(shí)顯著降低了11.57%;到800 ng/g處理時(shí)，則α-乙酸萘酯酶活性比對(duì)照和200 ng/g處理時(shí)分別顯著降低了14.90%和18.81%;1 100 ng/g處理時(shí)，α-乙酸萘酯酶活性比對(duì)照和 200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g處理時(shí)分別顯著降低了48.59%、50.95%、44.53%、39.59%。5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)α-乙酸萘酯酶活性也有類(lèi)似的變化趨勢(shì)，但只有在1 100 ng/g處理時(shí)，α-乙酸萘酯酶活性比對(duì)照、200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g 處理分別顯著降低了39.15%、43.74%、34.04%、38.54%。

圖1 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟體內(nèi)α-乙酸萘酯酶活性變化Fig.1 Changes of the activity of α-naphthylacetate esterase in-Ostrinia furnacalis larvea feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

不同含量Cry1Ac毒蛋白質(zhì)處理的亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)羧酸酯酶活性與對(duì)照相比均被抑制(3齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=5.93，P ＜0.05;5齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=6.34，P ＜ 0.05)。500 ng/g、800 ng/g和1 100 ng/g毒蛋白質(zhì)處理時(shí)，3齡幼蟲(chóng)該酶活性分別比對(duì)照顯著降低了23.53%、24.56%和25.44%;1 100 ng/g處理時(shí)，5齡幼蟲(chóng)羧酸酯酶活性分別比對(duì)照和200 ng/g處理顯著減少了30.00%和25.32%(圖2)。

圖2 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟體內(nèi)羧酸酯酶活性變化Fig.2 Changes of the activity of carboxylesterase in Ostrinia furnacalis larvae feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

亞洲玉米螟不同齡期的幼蟲(chóng)在取食不同含量Cry1Ac人工飼料后，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性受到顯著影響(3齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=5.77，P＜0.05;5齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=3.61，P＜0.05)。3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性除200 ng/g Cry1Ac處理外均低于對(duì)照，500 ng/g、800 ng/g和1 100 ng/g Cry1Ac 處理分別比對(duì)照降低了22.62%、23.18%、24.50%，分別比200 ng/g Cry1Ac處理顯著降低了29.57%、30.08%、31.28%。1 100 ng/g Cry1Ac處理的5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活性比對(duì)照顯著降低了20.04%(圖3)。

圖3 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性變化Fig.3 Changes of the activity of glutathione-S-transferase in-Ostrinia furnacalis larvea feeding on artificial diets with various contents of Cry1Ac

2.3 Cry1Ac毒蛋白質(zhì)對(duì)亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

從表2可以看出，Cry1Ac毒蛋白質(zhì)處理的亞洲玉米螟3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)超氧化物歧化酶活性受到顯著影響(df=4，F(xiàn)=6.27，P ＜0.05)，500 ng/g和 800 ng/g Cry1Ac處理時(shí)分別比對(duì)照顯著升高了43.78%和42.26%;5齡幼蟲(chóng)也有相同的變化趨勢(shì)，但差異不顯著(df=4，F(xiàn)=1.81，P ＞0.05)。

表2 取食不同含量Cry1Ac人工飼料后亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性變化Table 2 Changes in the activities of two protective enzymes in Ostrinia furnacalis larvae feeding on artificial diets with different contents of Cry1Ac

與超氧化物歧化酶活性變化相反，隨著Cry1Ac毒蛋白質(zhì)含量的增加過(guò)氧化氫酶活性逐漸下降(3齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=14.82，P＜0.05;5齡幼蟲(chóng):df=4，F(xiàn)=9.01，P ＜0.05)。其中 500 ng/g、800 ng/g和1 100 ng/g Cry1Ac處理的3齡幼蟲(chóng)該酶活性分別比對(duì)照顯著降低19.93%、33.39%、32.61%;1 100 ng/g Cry1Ac處理的5齡幼蟲(chóng)該酶活性分別比對(duì)照及200 ng/g Cry1Ac處理的顯著降低45.56%和45.12%。

3 討論

昆蟲(chóng)可以通過(guò)改變自身解毒酶或靶標(biāo)酶的特性等多種途徑以適應(yīng)寄主植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物［17］，解毒酶的變化反過(guò)來(lái)再改變其對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性。轉(zhuǎn)基因作物所表達(dá)的殺蟲(chóng)毒蛋白質(zhì)作為一種導(dǎo)入性外源毒素，同植物代謝的次生物質(zhì)和化學(xué)殺蟲(chóng)劑一樣，也可以引起昆蟲(chóng)體內(nèi)的相關(guān)解毒酶系和保護(hù)酶系等的活性變化，一方面對(duì)昆蟲(chóng)的持續(xù)作用可能會(huì)破壞其生理生態(tài)平衡，導(dǎo)致內(nèi)部穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，從而殺死害蟲(chóng);另一方面也可能誘導(dǎo)蟲(chóng)體產(chǎn)生一定的防御機(jī)制，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲(chóng)效果，甚至導(dǎo)致害蟲(chóng)的抗性發(fā)展等。大量的研究已證明了類(lèi)似的推斷［12，18-19］。

一些研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)體內(nèi)的各種酶活性與毒蛋白質(zhì)關(guān)系不顯著。丁雙陽(yáng)等的研究結(jié)果表明在飼喂轉(zhuǎn)Bt基因楊樹(shù)葉片后，美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)中腸乙酰膽堿酯酶活性與對(duì)照相比差異不顯著［20］。楊進(jìn)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)雙價(jià)基因棉SGK321對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性與對(duì)照間差異均不明顯［21］。劉旭的研究結(jié)果表明在取食轉(zhuǎn)SCK/Cry1Ac毒蛋白質(zhì)基因稻谷后，米蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性與對(duì)照性相比無(wú)顯著差異［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在取食含有Cry1Ac毒蛋白質(zhì)粉劑的人工飼料后，亞洲玉米螟3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性受到一定的抑制，且隨著毒蛋白質(zhì)含量的升高，與對(duì)照相比表現(xiàn)出顯著的抑制作用，而在200 ng/g毒蛋白質(zhì)下，α-乙酸萘酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性均較對(duì)照有所升高。徐艷聆等也發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn)Bt基因玉米48 h后亞洲玉米螟幼蟲(chóng)體內(nèi)的α-乙酸萘酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性明顯低于對(duì)照，而乙酰膽堿酯酶活性顯著高于對(duì)照，推斷乙酰膽堿酯酶可能與玉米螟對(duì)Bt毒蛋白質(zhì)的抗性有關(guān)［12］。因此Bt毒蛋白質(zhì)與昆蟲(chóng)體內(nèi)酶活的關(guān)系還有待進(jìn)一步論證。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著毒蛋白質(zhì)含量的升高，亞洲玉米螟幼蟲(chóng)SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在1 100 ng/g毒蛋白質(zhì)含量下SOD活性低于對(duì)照，而在其他毒蛋白質(zhì)含量處理下均高于對(duì)照，而CAT活性呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，呈抑制作用。解娜等的研究結(jié)果表明在取食Cry1Ac毒蛋白質(zhì)后，粘蟲(chóng)體內(nèi)的SOD活性顯著升高，而CAT活性受到顯著抑制［23］，與本研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，同一處理下，5齡幼蟲(chóng)的保護(hù)酶活力要高于3齡幼蟲(chóng)，而張巍等的研究結(jié)果表明在取食轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻后，短時(shí)間內(nèi)(48 h)隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，Bt處理組的3齡幼蟲(chóng)SOD活性先降低后上升，CAT活性在處理后期受到明顯抑制［24］，與本試驗(yàn)的結(jié)果有所不同，這可能是長(zhǎng)時(shí)間取食過(guò)程中的一個(gè)階段性變化。

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)作物中Bt蛋白質(zhì)的表達(dá)及轉(zhuǎn)Bt基因植物里植物次生代謝物的含量均受到多種因素的影響［25-26］。本試驗(yàn)沒(méi)有采用飼喂新鮮的轉(zhuǎn)基因植物組織來(lái)測(cè)定昆蟲(chóng)體內(nèi)的酶系活性，而是直接將Bt-Cry1Ac毒蛋白質(zhì)粉劑溶解后加入到人工飼料中進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)。二者所引起的昆蟲(chóng)相關(guān)響應(yīng)機(jī)制的形式與過(guò)程是否完全相同不甚清楚，有可能是各研究的結(jié)果不盡相同的原因。

綜上所述，亞洲玉米螟取食不同亞致死含量的Cry1Ac人工飼料后，體內(nèi)的相關(guān)酶活性都發(fā)生了不同程度的變化。在較低Cry1Ac含量時(shí)，蟲(chóng)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，部分解毒酶和保護(hù)酶活性被激活，對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行防御;隨著含量的增加，酶活性逐漸被抑制，顯著低于對(duì)照。而乙酰膽堿酯酶活性呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，這可能與昆蟲(chóng)的抗性有關(guān)。毒蛋白質(zhì)通過(guò)干擾SOD和CAT的活性，使蟲(chóng)體自由基清除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，擾亂正常的生理代謝，從而達(dá)到毒殺害蟲(chóng)的作用。

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