斜紋夜蛾核型多角體病毒DNA解旋酶序列比較分析

劉艷荷， 方繼朝

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014;2.廣東海洋大學農(nóng)學院，廣東 湛江 524088)

斜紋夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)隸屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)，α 桿狀病毒屬 Alphabaculovirus［1］。SpltNPV在自然界存在多種分離株，具有豐富的基因型多態(tài)性。根據(jù)宿主范圍、生長特性、多角體蛋白質(zhì)(Polyhedrin，polh)和DNA限制性酶切圖譜，Splt－NPV分為4組:AcNPV(Autographa californica NPV)型;SpliNPV(S.littoralis NPV)型:包括 SpliNPV－A和 SpliNPV－B;SpltNPV 特有基因型［2］。Kamiya 等［3］從日本采集17株病毒，空斑純化183個克隆，根據(jù)基因組DNA限制性酶切圖譜，分為A、B和C 3種基因型，A 型與 SliNPV－D［4］或 SliNPV－B［5］相似，B型與中國、日本、菲律賓的斜紋夜蛾幼蟲中鑒定的SpltNPV 相似［6－8］，而C 型SpltNPV 與A 型和 B 型都不同，是一種新型病毒。

DNA解旋酶(Helicase)是生物生命現(xiàn)象中的一種重要的酶，催化dsDNA向ssDNA的轉(zhuǎn)換，并參與新生鏈的合成，在DNA修復和重組過程中都發(fā)揮著必不可少的作用。桿狀病毒DNA解旋酶除了參與DNA復制外，在決定桿狀病毒宿主域方面有著重要的作用［9］。AcNPV和家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NPV，BmNPV)的 DNA解旋酶基因(helicase)是決定它們寄主范圍的重要基因［10－12］。克隆 AcNPV helicase，與 BmNPV 基因組DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細胞，篩選出既能感染所有Ac－NPV寄主，又可以在家蠶中表達的雜交病毒，其helicase基因首(1～780 bp)尾(2 795～3 669 bp)與BmNPV對應的DNA序列相同，但中間編碼的22個氨基酸與AcNPV相同［13］。本研究克隆Splt－NPV不同基因型克隆的helicase，對其核苷酸序列和氨基酸序列進行比較分析，為探討桿狀病毒宿主域擴大機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用病毒A6分離自SpltNPV埃及株，X8、X15和X17從來源于日本小笠原島的感病斜紋夜蛾幼蟲中分離獲得，保存在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所作物蟲害研究室(下文簡稱本實驗室)。病毒SeNPV以及克隆用大腸桿菌Escherichia coli TG1為本實驗室保存;Taq酶購自 TaKaRa公司，pGEM－T easy Vector、T4 DNA連接酶均購自Promega(美國)公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。離心機型號為Eppendorf 5417R和5810R?；蚝塑账嵝蛄袦y定在Invitrogen(美國)公司進行。

1.2 斜紋夜蛾的飼養(yǎng)

斜紋夜蛾幼蟲自南京郊區(qū)甘藍地采集，帶回實驗室飼養(yǎng)繁殖。幼蟲飼養(yǎng)溫度(27±1)℃，相對濕度60%，光周期14∶10(L∶D)。幼蟲以麥胚人工飼料在玻璃缸中群體飼養(yǎng)，4齡后以6孔板單頭飼養(yǎng);蛹放置于同樣的玻璃缸中，即將羽化時，移入成蟲籠。成蟲飼喂5%蔗糖水，以普通白紙置于籠壁供其產(chǎn)卵。

1.3 病毒的繁殖

通過幼蟲口服接種繁殖病毒。將人工飼料切成小塊放入6孔板，滴加適量濃度病毒，每孔接入2～3頭4齡初期斜紋夜蛾幼蟲，待其吃完病毒液飼料后再補充新鮮人工飼料。接毒幼蟲飼養(yǎng)條件為:飼養(yǎng)溫度(27±1)℃，相對濕度60%，光周期14∶10(L∶D)。幼蟲發(fā)病后收集染病蟲體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒基因組DNA的提取

將收集的病蟲研磨，紗布過濾移除蟲體碎屑。差速離心500 r/min 5 min，3 000 r/min 5 min，進行多角體純化。將純化的多角體(POBs)109個懸浮于300 μl ddH2O，加入 100 μl 3 × DAS 堿裂解液(0.3 mol/L Na2CO3，0.5 mol/L NaCl，0.03 mol/L EDTA，pH 10.5)，37℃水浴10 min。待裂解液變清后，加入 200 μl TE(pH 8.0)，8 000 r/min離心 8 min。移出上清，加入蛋白酶K至終濃度200 μg/ml，45～50℃水浴2.5 h，再加入10%SDS至終濃度1%，繼續(xù)水浴30 min。苯酚抽提1次，苯酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)抽提2次，再用無水乙醇沉淀基因組 DNA，干燥后溶解于 TE(pH 8.0)備用［14～16］。

1.5 PCR擴增及擴增產(chǎn)物的克隆

參照 GenBank登錄的 SpltNPV(AF527603)、SpltNPV2(NC_011616)基因組全序列設(shè)計引物(表1)，以方法1.4提取的病毒基因組DNA為模板，PCR擴增，將所得片段克隆入pGEM－T easy Vector，測序拼接。

表1 試驗中所用的PCR引物Table 1 PCR primers used in the experiments

1.6 核苷酸及氨基酸序列的比較

將所得的病毒helicase核苷酸序列和氨基酸序列與SpltNPV不同基因型及其他核型多角體病毒的helicase序列，利用Blast、Clustal W等軟件進行同源性比較和分子進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SpltNPV不同基因型helicase的克隆

SpltNPV 3種基因型，A型和B型同源性較高，而C基因型與A型和B型的同源性較低，因此需要以SpltNPV和SpltNPV2基因組全序列為模板分別設(shè)計引物。SpltNPV helicase長3 708 bp，編碼1 235個氨基酸;SpltNPV2 helicase長3 654 bp，編碼1 217個氨基酸，為方便PCR擴增，設(shè)計2對引物。利用這些引物，分別以A6、X8、X15和X17病毒基因組DNA為模板，PCR擴增出8條1 800 bp左右的片段，克隆到pGEM－T easy Vector中測序(圖1)。進行序列拼接后，得到 A6、X8、X15和 X174個病毒克隆 helicase的完整編碼區(qū)。

圖1 斜紋夜蛾核型多角體病毒A6、X8、X15和 X17株helicase PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis of helicase PCR products from SpltNPV A6，X8，X15，and X17isolates

2.2 SpltNPV不同基因型helicase的序列比較分析

SpltNPV 病毒克隆 A6、X8、X15的 helicase編碼區(qū)全長相同，為3 756 bp，比SpltNPV helicase長48 bp，分別在302～316 nt、333～360 nt和2 599～2 604 nt插入15 bp、27 bp 和 6 bp。SpltNPV helicase與 A6、X8、X15的helicase核苷酸序列相似性分別為89%、89%和91%，而A6和X8與X15的相似性都是97%，A6和 X8的相似性為99%。A6、X8和 X15的 helicase氨基酸序列全長1 251個氨基酸，比SpltNPV helicase長16個氨基酸，分別在95～104個氨基酸、117～121個氨基酸和837～838個氨基酸處插入9個、5個和2個氨基酸。A6、X8和 X15的 helicase與SpltNPV helicase氨基酸序列相似性均為93%，A6和X8與X15氨基酸序列相似性均為99%。

SpltNPV病毒克隆X17的helicase編碼區(qū)全長3 699 bp，比 SpltNPV2 helicase 長 45 bp，分別在2 167～2 178 nt、2 345～2 374 nt和2 483～2 485 nt處插入12 bp、30 bp和3 bp，核苷酸序列的相似性為90%。X17helicase比SeNPV helicase長30 bp，在26～28 nt和2 491～2 493 nt處各缺失 3 bp，而在2 157 ～2 159 nt、2 172 ～ 2 186 nt、2 353 ～2 364 nt、2 389 ～2 391 nt、2 440 ～2 442 nt處分別插入 3 bp、15 bp、12 bp、3 bp 和 3 bp，核苷酸序列的相似性為82%。X17helicase全長1 232個氨基酸，比SpltNPV2－h(huán)elicase長15個氨基酸，在720～723個氨基酸、784～793個氨基酸和813個氨基酸處分別插入4個氨基酸、10個氨基酸和1個氨基酸，氨基酸序列相似性為92%。X17－h(huán)elicase比 SeNPV－h(huán)elicase多編碼10個氨基酸，在第8個氨基酸、812～813個氨基酸和827～830個氨基酸處分別缺失1個氨基酸、2個氨基酸和4個氨基酸，而在725～730個氨基酸、837～847個氨基酸處分別插入6個氨基酸、11個氨基酸，氨基酸序列相似性為83%。

A6、X8、X15的 helicase 和 X17的 helicase 同源性低，核苷酸序列相似性均為52%，氨基酸序列的相似性均為42%。

2.3 SpltNPV－h(huán)elicase的進化分析

從GenBank下載33種NPV的helicase氨基酸序列(表2)，利用 Clustal W 和 Treeview(V.1.6.6)軟件，繪制SpltNPV不同基因型及克隆和下載的33種NPV的系統(tǒng)進化樹(圖2)。在進化樹上SpltNPV不同基因型及克隆分別處于兩大分枝上:X17、Splt－NPV2、SeNPV和SfMNP處在一個分支;因SpliNPV的helicase序列在GenBank上沒有登錄，SpltMNP與分離自日本小笠原株的X8和X15、分離自埃及株的A6及LsNPV處在一個分支上，這與多角體蛋白質(zhì)基因核苷酸序列的進化分析結(jié)果基本一致［17］。本試驗克隆的A6和X8同源性高，在一個小的分支上，然后和X15匯合一個較大的分支，再與SpltNPV匯合在一起，最后與LsNPV構(gòu)成一個較大的分支。

圖2 SpltNPV 6種基因型及克隆和33種桿狀病毒helicase氨基酸序列的NJ進化樹Fig.2 The NJ phylogenetic tree of 6 SpltMNPV genotypes and 33 nucleopolyhedrovirus based on helicase amino acid sequences

表2 進化分析中所用SpltNPV不同基因型和其他33種NPV的helicase基因Table 2 Helicase genes of SpltMNPV genotypes and other 33 NPVs used in the phylogenetic analysis

3 討論

本研究克隆了 4株(A6、X8、X15和 X17)病毒的helicase基因，從同源性分析結(jié)果看，A6、X8、X15與SpltNPV同源性較高，核苷酸序列的相似性分別為89%、91%和89%，氨基酸序列的相似性都是99%。因為SpliNPV的helicase基因在GenBank上沒有登錄，無法進行同源性比較，因此單就helicase序列，無法判斷A6、X8、X15屬于 SpliNPV型(A基因型)或SpltNPV型(B基因型)。X17與SpltNPV2、SeNPV同源性較高，核苷酸序列的相似性分別為90%和82%，氨基酸序列的相似性分別為92%和83%，而與SpltNPV同源性較低，核苷酸序列的相似性為52%，氨基酸序列的相似性為42%，因此X17屬于SeNPV型(C基因型)。從進化分析結(jié)果看，A6、X8和X15在同一大的分支，而X17與SpltNPV2和SeNPV在同一大的分支，這與以多角體蛋白質(zhì)基因核苷酸序列的進化分析結(jié)果一致。在克隆的4株病毒helicase基因中，A6、X8、X15之間序列差異比較小，可能由于克隆的病毒株數(shù)較少，沒有包括與SpltNPV親緣關(guān)系最近的病毒株，也可能在自然界中，SpltNPV和SpliNPV發(fā)生同源重組，使得該基因逐漸趨于相似，如這兩種基因型的幾丁質(zhì)酶基因、核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均為99%［18］。

SpltNPV2基因組全序列已被測定(NC_011616)，全長148 634 bp，150 bp以上的 ORFs 149個，基因組比SpltNPV長9 kb，多9個ORFs，兩者之間96個ORFs有同源性，氨基酸序列相似性平均為44.6%，基因順序存在很大差異。SpltNPV2比SeNPV基因組長13 kb，但兩個病毒間133個ORFs具有同源性，氨基酸序列相似性平均76.5%，而且基因順序存在明顯一致性。雖然SpltNPV2與SpltNPV來源于相同的宿主。但是它們之間的同源性遠不如SpltNPV2和 SeNPV 高［19］。X17是從日本小笠原采集的病毒株分離獲得，已對其部分基因進行了克隆，發(fā)現(xiàn)其基因與SpltNPV2和SeNPV同源性高［17］。本試驗以X17和SeNPV飼喂甜菜夜蛾幼蟲，發(fā)現(xiàn)該病毒對甜菜夜蛾的感染率為44%，但甜菜夜蛾幼蟲致死時間與感染斜紋夜蛾致死時間相當，遠遠長于SeNPV感染甜菜夜蛾的致死時間。另外也有報道SpltNPV能夠侵染甜菜夜蛾的細胞核幼蟲［20］。目前已證實DNA helicase是決定AcNPV和BmNPV宿主范圍的重要基因，但不同桿狀病毒之間，其宿主域決定機制不同。至于在SpltNPV中，helicase基因是否與病毒宿主域或侵染時間有關(guān)，還需要進行基因刪除等試驗進一步研究確定。

［1］KING A M，LEFKOWITZ E，ADAMS M J，et al.Virus taxonomy:ninth report of the international committee on taxonomy of viruses［M］.Elsevier:Academic Press，2011.

［2］MAEDA S，MUKOHARA Y，KONDO A.Characteristically distinct isolates of the nuclear polyhedrosis virus from Spodoptera litura［J］.J Gen Virol，1990，71:2631－2639.

［3］KAMIYA K，ZHU J，MURATA M，et al.Cloning and compara－tive characterization of three distinct nucleopolyhedroviruses isolated from the cotton cutworm，Spodoptera litura(Lepidoptera:Noctuidae)in Japan［J］.Biological Control，2004，31(1):38－48.

［4］KISLEV N，EDELMAN M.DNA restriction pattern differences from geographic isolates of Spodoptera littoralis nuclear polyhedrosis virus［J］.Virology，1982，119:219－222.

［5］CHERRY C L，SUMMERS M D.Genotypic variation among wild isolates of two nuclear polyhedrosis viruses isolated from Spodoptera littoralis［J］.J Invertebr Pathol，1985，46:289－295.

［6］LAVI?A－CAOILI B A，KAMIYA K，KAWAMURA S，et al.Comparative in vitro analysis of geographic variants of nucleopolyhedrovirus of Spodoptera litura isolated from China and the Philippines［J］.J Insect Biotechnol Sericol，2001，70:199－209.

［7］PANG Y，YU J，WANG L，et al.Sequence analysis of the Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus genome ［J］.Virology，2001，287(2):391－404.

［3］TAKATSUKA J，OKUNO S，NAKAI M，et al.Genetic and biological comparisons of ten geographic isolates of a nucleopolyhedrovirus that infects Spodoptera litura(Lepidoptera:Noctuidae)［J］.Biological Contro1，2003，26:32－39.

［9］肖慶利，張志芳，何家祿.桿狀病毒DNA解旋酶［J］.生命的化學，2001，21(6):456－458.

［10］MAEDA S，KAMITA S G，KONDO A.Host range expansion of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(NPV)following recombination of a 0.6－kilobase－pair DNA fragment originating from Bombyx mori NPV［J］.J Virol，1993，67(10):6234－6238.

［11］JIN B R，YOON H J，CHOUDARY P V，et al.Characterization of recombinant Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(NPV)expressing the beta－galactosidase gene in both Sf21 and Bm5 cells by Bombyx mori NPV p143 helicase gene［J］.Mol Cells，1997，7(6):762－768.

［12］KAMITA S G，MAEDA S.Sequencing of the putative DNA helicase－encoding of the Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and fine－mapping of a region involved in host range expansion［J］.Gene，1997，190(1):173－179.

［13］吳小鋒，曹翠萍，許雅香，等.BmNPV和AcNPV擴大寄主域雜交重組病毒表達載體的構(gòu)建和改進［J］.中國科學(C輯，生命科學)，2004，34(2):156－164.

［14］郭慧芳.昆蟲核型多角體病毒的增效途徑和機理［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學，2005.

［15］GUO H F，F(xiàn)ANG J C，WANG J P，et al.Interaction of Xestia cnigrum granulovirus with peritrophic matrix and Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus in Spodoptera litura［J］.Journal of Economic Entomology，2007，100(1):20－25.

［16］GUO H F，F(xiàn)ANG J C，LIU B S，et al.Enhancement of the biological activity of nucleopoly－h(huán)edrovirus through disruption of the peritrophic matrix of insect larvae by chlorfluazuron ［J］.Pest Management Science，2007，63(1):68－74.

［17］劉艷荷，郭慧芳，方繼朝.C型斜紋夜蛾核型多角體病毒X17病毒株部分基因的序列分析［J］.昆蟲學報，2011，54(9):1010－1017.

［18］劉艷荷，方繼朝.斜紋夜蛾核型多角體病毒不同分離株基因序列的同源性分析［J］. 昆蟲學報，2008，51(8):817－823.

［19］李軼女.東方粘蟲顆粒體病毒和斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ基因組全序列分析［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學院，2008.

［20］TAKATSUKA J，OKUNO S，ISHII T，et al.Host range of two multiple nucleopolyhedroviruses isolated from Spodoptera litura［J］.Biological Control，2007，41:264－271.