耐鹽柳樹BADH基因克隆及表達(dá)分析

李 敏， 張 健， 王奎山， 李玉娟， 談 峰， 王 瑩

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 如皋 226541)

大多數(shù)高等植物在受到鹽、干旱等脅迫時(shí)會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量甘氨酸甜菜堿(簡稱甜菜堿)來提高自身抵抗逆境環(huán)境因子脅迫的能力［1］。甜菜堿作為季胺類水溶性生物堿，具有滲透調(diào)節(jié)功能，能夠保護(hù)質(zhì)膜的完整性，有助于植物適應(yīng)非生物逆境［2-3］。

耐鹽柳樹，具有較強(qiáng)的耐鹽能力，能在含鹽0.4%、pH 10.4的土壤中正常生長，是中國沿海灘涂主要的造林樹種之一。耐鹽柳樹適應(yīng)性強(qiáng)，易繁殖，造林成活率高，生長迅速，無論在營造工業(yè)用材林，還是在防風(fēng)固沙、水土保持、鹽堿地改造等方面都有廣闊的應(yīng)用前景［4］。目前，國內(nèi)外學(xué)者已從川芎(Liqusticum churning Franch Hort)、枸杞(Lycium barbarum)、刺五加(Eleutherococcus senticosus)、甘菊(Dendranthema lavandulifolium)、胡楊(Populus euphratica)、遼寧堿蓬 (Suaeda liaotungensis)、梭 梭(Haloxy lonammodendron)、鹽爪爪(Kalidium foliatum)、大麥(Hordeum vulgare L.)、鹽穗木 (Halostachys caspica)等［5-14］植物中相繼克隆得到甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因，但有關(guān)耐鹽柳樹BADH基因的研究還未見報(bào)道。本研究擬從耐鹽柳樹中克隆BADH基因，探討其與其他品種或物種同源基因的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)其進(jìn)行序列分析和在鹽脅迫下的表達(dá)分析，旨在為耐鹽柳樹種質(zhì)改良研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試植物為江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的耐鹽柳樹L0911，取新鮮葉片，用液氮速凍存于－70℃冰箱待用。

1.2 試劑

引物 Taq DNA聚合酶、dNTP(10 mmol/L)、DNA marker和 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工SK1141)、質(zhì)粒提取試劑盒(生工 SK1191 UNIQ-10)、熒光定量PCR用試劑盒(SK8661)、常規(guī)化學(xué)試劑等均購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 RNA提取和總cDNA的合成

采用Trizol試劑(Invitrogen公司)參照試劑說明手冊(cè)提取總RNA?？俢DNA的合成用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(BBI公司)按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 BADH 基因克隆

根據(jù)毛果楊(Populus trichocarpa)的PtBADH設(shè)計(jì)引物BADH F1:5'-AGCTCTCAACTCACTAATCGAGT-3';BADH R1:5'-TTATAGCTTGGCGGGAGACTG-3'。以L0911葉片總cNDA為模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，切膠回收，并進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T)。陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。所得的克隆序列為2次獨(dú)立PCR和3個(gè)以上質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果。

1.5 BADH基因的分子進(jìn)化分析

在GenBank查找BADH基因的核苷酸和氨基酸相關(guān)序列，使用 Clustal W2進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA5.0軟件中 Neighbor-Joining(NJ)法進(jìn)行建樹，Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.6 鹽處理

將水培生長健壯的柳樹L0911幼苗用200 mmol/L NaCl溶液分別處理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，取新鮮嫩葉片。將 L0911幼苗分別用 0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L 、300 mmol/L NaCl溶液處理12 h后，取新鮮嫩葉片。所有樣品用液氮速凍存于－70℃冰箱待用。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物BADH F2(5'-GTGCCAAGTATTTGCGTGCTA-3')和BADH R2(5'-AAACAACCTGCGACATCATCC-3')，對(duì)L0911 BADH基因鹽脅迫處理后的響應(yīng)進(jìn)行分析。用ubiquitin-like(UBQ-L)［15］為內(nèi)參基因，引物為 UBQ-L-F(5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3')和UBQ-L-R(5'-T GTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3')。將經(jīng)過鹽處理的柳樹L0911幼苗嫩葉進(jìn)行總RNA提取以及cDNA合成。按柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(SK8661)配制PCR體系，于ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，測(cè)定其Ct值，用 F=2－△△Ct公式［16］計(jì)算樣品間目的基因的表達(dá)量差異。

2 結(jié)果

2.1 柳樹L0911 BADH基因的克隆

從圖1可以看出，引物BADH F1和BADH R1在柳樹L0911的cDNA模板中成功擴(kuò)增到目的片段，長度大小符合預(yù)期目標(biāo)。測(cè)序結(jié)果表明，L0911的BADH基因cDNA全長1 539 bp，具有起始密碼子、完整的開放閱讀框(1 512 bp)、終止密碼子、5'非編碼區(qū)(27 bp)，共編碼512個(gè)氨基酸。獲得的氨基酸序列與毛果楊PtBADH2、胡楊PeBADH2編碼序列以及擬南芥、水稻的氨基酸序列相似性達(dá)到95.83%、95.03%、82.31%、71.68%。說明本試驗(yàn)獲得的基因與PtBADH2和PeBADH2是同源的。

圖1 引物BADH-F1/R1擴(kuò)增柳樹L0911 cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Amplification of Salix cultivar L0911 cDNA by PCR using primers BADH-F1/R1

2.2 柳樹L0911氨基酸序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用MEGA 5.0對(duì)BADH基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析，結(jié)果與用基因組序列(www.phytozome.net)分析結(jié)果一致。柳樹 L0911的BADH基因與楊樹位于相同的分支(圖2)。在胡楊［9］、白骨壤［17］、麻瘋樹［18］等植物中，BADH 基因的功能已有報(bào)道，本研究獲得的BADH可能具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。

圖2 植物BADH基因編碼氨基酸的分子進(jìn)化分析圖Fig.2 Phylogentic tree of BADH gene of various plants based on amino acids sequence

2.3 鹽脅迫下柳樹L0911 BADH基因的表達(dá)分析

2.3.1 不同濃度 NaCl溶液脅迫下柳樹L0911BADH基因的表達(dá)特性 以未進(jìn)行NaCl脅迫處理的葉片中BADH基因的表達(dá)量為對(duì)照，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量中得到的目的基因BADH和內(nèi)參基因UBQ-L的平均Ct值，計(jì)算作圖，得到圖3。可以看出柳樹L0911葉片中BADH基因的表達(dá)情況隨著鹽濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，在200 mmol/L NaCl脅迫下表達(dá)量最高，是對(duì)照的1.90倍。說明一定濃度的 NaCl脅迫可以誘導(dǎo)柳樹 L0911的BADH基因表達(dá)量增加，但鹽濃度過高BADH基因表達(dá)量又會(huì)下降。

圖3 不同NaCl濃度脅迫12 h后柳樹L0911 BADH基因的表達(dá)Fig.3 Expression of BADH gene of Salix cultivar L0911 under NaCl stress for 12 h at different concentrations

2.3.2 NaCl不同脅迫時(shí)長下 L0911BADH基因的表達(dá)特性 從圖4可以看出，隨NaCl脅迫時(shí)間的延長，葉片中BADH基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。脅迫初期(3 h)，L0911 BADH基因表達(dá)量低于對(duì)照;隨著時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸增大，脅迫12 h時(shí)達(dá)到最高，是對(duì)照組的1.88倍，說明鹽脅迫能誘導(dǎo)該基因表達(dá)量的增加;隨著時(shí)間進(jìn)一步延長，表達(dá)量逐漸降低，脅迫72 h時(shí)表達(dá)量低于對(duì)照水平。

圖4 200 mmol/LNaCl脅迫不同時(shí)間柳樹L0911 BADH基因的表達(dá)Fig.4 Expression of BADH gene of Salix cultivar L0911 under 200 mmol/L NaCl stress for different times duration

3 討論

植物在干旱、鹽堿等逆境條件下可積累大量甜菜堿，而植物體內(nèi)甜菜堿的合成途徑相對(duì)簡單，主要經(jīng)兩步催化合成，即乙酰膽堿→甘氨酸甜菜堿醛→甘氨酸［19］。甜菜堿合成后不能進(jìn)一步代謝，積累在細(xì)胞中作為永久性或半永久性滲透調(diào)節(jié)劑［20］。因此，甜菜堿合成途徑中的甜菜堿醛脫氫酶(BADH)被認(rèn)為是最有希望的脅迫抗性基因之一，BADH的分子生物學(xué)與生物化學(xué)研究引起了廣泛關(guān)注。本研究從柳樹L0911克隆到BADH基因，并對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、表達(dá)模式進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究。

本研究采用同源克隆法從柳樹L0911cDNA中擴(kuò)增并克隆了BADH基因。測(cè)序結(jié)果表明，該基因含有1個(gè)完整的開放閱讀框架，核苷酸序列全長為1 539 bp，推測(cè)的氨基酸序列全長為512個(gè)氨基酸殘基。氨基酸序列同源性分析表明L0911的BADH基因與毛果楊、胡楊等同源性最近，為95%，與水稻的同源性為71%。L0911的BADH氨基酸序列同源性分析也表明BADH在高等植物中是相對(duì)保守的。

植物在逆境條件下會(huì)積累甜菜堿，BADH基因的表達(dá)活性又直接影響甜菜堿的合成。本試驗(yàn)用熒光定量的方法檢測(cè)柳樹L0911在鹽脅迫下BADH mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，BADH基因是受鹽誘導(dǎo)的，當(dāng)鹽濃度升高至200 mmol/L時(shí)，表達(dá)活性最大;在同一鹽濃度下，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，在一定范圍內(nèi)，表達(dá)活性也增大。Arakawa等［21］研究結(jié)果表明大麥(Hordeum vulgare)BADH酶活性隨著鹽濃度的增加而增大;Reda等［22］研究結(jié)果也表明鹽角草(Salicornia europaea)和堿蓬(Suaeda maritima)的BADH mRNA在鹽脅迫下的表達(dá)水平增加，本研究結(jié)果與他們基本一致。這為進(jìn)一步揭示L0911的耐鹽機(jī)制及利用該基因進(jìn)行遺傳工程創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

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