基于CSSL的水稻苗期耐亞鐵離子脅迫QTL定位

趙春芳， 周麗慧， 丁 丹， 張亞東， 趙慶勇， 于 新， 朱 鎮(zhèn)， 陳 濤， 姚 姝，王才林

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京210014)

潛育性水稻土是淹水條件下形成的還原性低產(chǎn)土壤，大面積存在于中國南方稻區(qū)。這類稻田由于長期浸水，通氣性差，積累了大量的還原性物質(zhì)，其中亞鐵離子(Fe2+)被認(rèn)為是限制水稻生長的最主要物質(zhì)。水稻遭受Fe2+毒害時(shí)，生長發(fā)育受到明顯抑制，生物量和產(chǎn)量大幅下降［1］。水稻耐Fe2+毒害遺傳基礎(chǔ)的研究，對(duì)利用分子標(biāo)記輔助選育耐Fe2+毒害的水稻品種、緩解潛育性水稻田的鐵毒危害具有重要意義。

迄今，國內(nèi)外對(duì)水稻耐Fe2+脅迫的遺傳研究已有一些報(bào)道［2-10］。Wu 等［2-3］利用 DH 群體，以葉斑指數(shù)、鐵離子濃度及抗壞血酸過氧化物酶等一系列酶活性為耐性指標(biāo)，共檢測(cè)到5個(gè)耐Fe2+脅迫的QTL，分布于水稻第1、2 和7 染色體上。Wan 等［4，6］利用“Nipponbare/Kasalath”BILs群體，以 Fe2+脅迫下的水稻葉斑指數(shù)、地上部和根系干物質(zhì)重以及分蘗數(shù)等性狀為耐性指標(biāo)，定位到3個(gè)QTL，分布于水稻第1和3染色體上。Wan等［5］利用CSSL群體為材料，檢測(cè)到14個(gè)與耐Fe2+脅迫有關(guān)的QTL，分布于水稻第3、6、9、11 和12 染色體上。Wan 等［7］利用F2/F3群體，以溶液培養(yǎng)方式，定位了20個(gè)Fe2+脅迫下的葉斑指數(shù)、株高和根長等性狀的QTL，分布于水稻10條染色體上。葉紅霞等［9］利用RILs群體定位了4個(gè)耐Fe2+脅迫的水稻相對(duì)苗高QTL，分別位于第1、3、6 和 9 染色體上。Dufey 等［10］利用 RILs群體定位了24個(gè)Fe2+脅迫下控制葉斑指數(shù)、干物質(zhì)重、鐵離子濃度、葉綠素含量等性狀的QTL，分布于水稻第1、2、3、4、7和11染色體上。這些研究結(jié)果表明水稻中存在眾多耐Fe2+脅迫基因，不同遺傳群體所含的耐性基因也不盡相同。

水稻耐Fe2+毒害的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，涉及的基因較多，到目前為止人們對(duì)其遺傳機(jī)制的認(rèn)識(shí)還相當(dāng)缺乏，尤其是幼苗期的相關(guān)研究尚少。本研究利用一套以秈稻品種9311與粳稻品種日本晴雜交后代衍生的遺傳背景為9311的染色體片段置換系(Chromosome segment substitution line，CSSL)為材料，以幼苗耐Fe2+脅迫所表現(xiàn)的相對(duì)根長性狀為指標(biāo)，進(jìn)行QTL定位分析，以探討水稻耐Fe2+脅迫的遺傳基礎(chǔ)，為分子標(biāo)記輔助選育耐性品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以秈稻品種9311(Oryza sativa L.ssp.indica cv.9311)為受體親本，粳稻品種日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)為供體親本，得到雜交后代BC4F1。用覆蓋水稻全基因組的親本間具多態(tài)性的28對(duì)SSR(Simple sequence repeat)引物檢測(cè)BC4F1單株的基因型，對(duì)于雜合片段在2個(gè)及以上的單株予以淘汰，其他無雜合片段或只有1個(gè)雜合片段的單株繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)。通過篩選，獲得含1個(gè)或2個(gè)雜合片段的135個(gè)單株，繼續(xù)種植得到BC4F2群體。每個(gè)BC4F2群體中取47株進(jìn)行基因型檢測(cè)，最后獲得119個(gè)純合的染色體片段置換系［11］，根據(jù)已構(gòu)建的物理圖譜［12］，計(jì)算置換片段在水稻全基因組上的覆蓋率為83.98%。

1.2 溶液培養(yǎng)

試驗(yàn)于2012年10～11月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)溫度白天控制在30℃左右，晚上在22℃左右，采用自然光照條件。水稻基本營養(yǎng)液配制參照國際水稻所配方［13］;Fe2+脅迫溶液是在基本營養(yǎng)液中加入FeSO4·7H2O配制成的含250 mg/L Fe2+的溶液。

將119個(gè)CSSL及親本稻谷經(jīng)浸種催芽后播種于底部粘著紗網(wǎng)的泡沫孔板上，每系播種1孔，每孔30粒。將播種的孔板漂浮在裝有15 L自來水的周轉(zhuǎn)箱中培養(yǎng)3 d，然后在1/2濃度基本營養(yǎng)液和基本營養(yǎng)液中依次各培養(yǎng)5 d。每系及親本選取生長一致的10株幼苗，均分成2份(每份5株)，種植于特制的單苗培養(yǎng)孔板上，分別進(jìn)行Fe2+脅迫和基本營養(yǎng)液培養(yǎng)，以基本營養(yǎng)液的培養(yǎng)作為對(duì)照。每3 d更換1次培養(yǎng)液，每次調(diào)節(jié)溶液pH=4.5。試驗(yàn)設(shè)置2次重復(fù)。

1.3 耐Fe2+脅迫的性狀鑒定

脅迫處理2周后進(jìn)行性狀調(diào)查，分別測(cè)量對(duì)照和Fe2+脅迫下5株苗的最長根長度。以相對(duì)根長性狀來衡量供試材料對(duì)Fe2+脅迫的耐性程度。相對(duì)根長值用Fe2+脅迫處理下的根長與對(duì)照的根長之比表示，即相對(duì)根長=Fe2+脅迫處理的根長/對(duì)照根長×100%。相對(duì)根長值越大，說明受Fe2+毒害越小，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐Fe2+脅迫能力;相對(duì)根長值越小，說明受Fe2+毒害越大，表現(xiàn)為對(duì)Fe2+脅迫敏感。以2次重復(fù)的平均值為統(tǒng)計(jì)單元進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 QTL 分析

利用t測(cè)驗(yàn)對(duì)相對(duì)根長性狀進(jìn)行差異顯著性分析，檢測(cè)各CSSL與受體親本9311之間的差異顯著性，以α=0.01為閾值，即P≤0.01時(shí)認(rèn)為該系所帶的置換片段上有相關(guān)QTL存在;否則認(rèn)為QTL不存在。參照Eshed等［14］的方法檢測(cè)各個(gè)QTL的加性效應(yīng)值(Additive effect，AE)及加性效應(yīng)百分率(Additive effect contribution，AC)，加性效應(yīng)值 =(CSSL的表型值－9311的表型值)/2，加性效應(yīng)百分率=(加性效應(yīng)值/9311的表型值)×100%。

QTL命名遵循McCouch等［15］制定的原則。

1.5 基因型分析和QTL定位

根據(jù)已構(gòu)建的9311為遺傳背景的119個(gè)CSSL的物理圖譜，進(jìn)行染色體片段置換系的基因型分析。QTL作圖參照 Paterson等［16］的方法，如果在含有重疊置換片段的不同CSSL中同時(shí)檢測(cè)到QTL，且遺傳效應(yīng)方向一致，則認(rèn)為該QTL存在于各置換片段的重疊區(qū)段上;如果在一個(gè)CSSL中檢測(cè)到QTL，而在置換片段具有重疊關(guān)系的另一CSSL中未被檢測(cè)到，則認(rèn)為該QTL位于兩個(gè)置換片段的非重疊區(qū)段上。

2 結(jié)果

2.1 親本及置換系耐Fe2+脅迫的表型分析

t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明受體親本9311和供體親本日本晴的相對(duì)根長在2個(gè)重復(fù)間均未達(dá)到顯著差異(P＞0.05)，而在2個(gè)重復(fù)中兩親本之間的相對(duì)根長差異均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。9311的相對(duì)根長為(55.74±7.41)%，日本晴的相對(duì)根長為(85.22±8.33)%(圖1)，說明日本晴較9311有更強(qiáng)的耐Fe2+脅迫能力。CSSL群體的相對(duì)根長值主要集中在50% ～70%，平均值為62.42%，變異范圍為24.20% ～95.53%，表現(xiàn)單峰連續(xù)分布，并且出現(xiàn)超親變異(圖1)?？梢?，該CSSL群體的相對(duì)根長性狀存在明顯的遺傳變異，適合于QTL分析。

圖1 Fe2+脅迫下相對(duì)根長性狀在CSSL群體中的分布Fig.1 Distribution for relative root length under Fe2+stress in CSSL population

2.2 水稻耐Fe2+脅迫的QTL分析

t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，在119個(gè)CSSL中檢測(cè)到14個(gè)CSSL的相對(duì)根長與受體親本9311之間存在極顯著差異(表1)。CSSL117的相對(duì)根長值為24.19%，加性效應(yīng)值為－15.78，加性效應(yīng)百分率為－28.30%，表現(xiàn)為對(duì)Fe2+脅迫敏感。其余13個(gè)CSSL的加性效應(yīng)值均為正，變化范圍為7.63～19.88，加性效應(yīng)百分率變化范圍為13.69% ～35.66%，表現(xiàn)為較9311更強(qiáng)的耐Fe2+脅迫能力。根據(jù)已構(gòu)建的物理圖譜［12］，對(duì)14個(gè)CSSL進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)日本晴置換片段分布于水稻第2、5、6、7和12染色體上(圖2)。利用代換作圖方法，共檢測(cè)出9個(gè) QTL，分別為 qRRL2-1、qRRL2-2、qRRL2-3、qRRL5、qRRL6-1、qRRL6-2、qRRL6-3、qRRL7和qRRL12。其中qRRL12的加性效應(yīng)值為負(fù)，效應(yīng)來源于9311的等位基因;其余8個(gè)QTL的加性效應(yīng)均表現(xiàn)為增效作用，來源于日本晴的等位基因。在增效QTL中，qRRL5、qRRL2-2和qRRL6-2的加性效應(yīng)值較大，加性效應(yīng)百分率分別為35.66%、23.37%和20.84%。

圖2 14個(gè)CSSL的置換片段在水稻12條染色體上的分布Fig.2 Distribution of substituted segments from 14 CSSLs on 12 rice chromosomes

表1 兩親本及14個(gè)CSSL的表現(xiàn)及QTL分析Table 1 Phenotypic response and QTL analysis of 14 CSSLs and two parents

2.3 水稻耐Fe2+脅迫的QTL代換作圖

對(duì)與受體親本9311在相對(duì)根長上存在顯著差異的14個(gè)CSSL進(jìn)行重疊置換片段分析，檢測(cè)到的9個(gè)QTL中有4個(gè)QTL只在含1個(gè)重疊片段的CSSL中被檢測(cè)到，圖3顯示了其置換片段的物理位置和長度。qRRL2-1被定位在第2染色體RM3340至RM233A之間、物理距離為1.35 Mb的置換片段上，qRRL5被定位在第5染色體RM1024至RM405之間0.95 Mb的物理距離內(nèi)，qRRL6-1被定位在第6染色體頂端RM469處、物理距離為1.15 Mb的置換片段上，qRRL12被定位在第12染色體RM3331至RM12之間約1.75 Mb的物理距離內(nèi)(圖3)。

圖3 Fe2+脅迫下來自1個(gè)置換片段的4個(gè)相對(duì)根長QTL的定位Fig.3 Mapping of four QTLs for relative root length identified from one substituted segment under Fe2+stress

其他5個(gè)QTL均在含2～3個(gè)重疊置換片段的CSSL中被檢測(cè)到。通過代換作圖法，將qRRL2-2和qRRL2-3分別定位到第2染色體RM5390～RM3795和 RM262～RM3512、物理距離分別為5.80 Mb和4.80 Mb的置換片段上，將qRRL6-2和qRRL6-3分別定位于第6染色體RM527～RM3498和RM3138～RM494、物理距離分別為10.15 Mb和1.65 Mb的置換片段上，將qRRL7定位在第7染色體RM1253～S7－9.61之間1.30 Mb的物理距離內(nèi)(圖4)。

圖4 Fe2+脅迫下來自2～3個(gè)重疊置換片段的5個(gè)相對(duì)根長QTL的代換作圖Fig.4 Mapping of five QTLs for relative root length identified from 2 －3 substituted segments under Fe2+stress

綜上，圖5顯示了9個(gè)耐Fe2+脅迫相關(guān)QTL在水稻高密度物理圖譜上的分布及物理位置。

圖5 Fe2+脅迫下9個(gè)相對(duì)根長QTL在水稻染色體上的物理位置及長度Fig.5 Physical location and length of nine QTLs for relative root length on rice chromosomes under Fe2+stress

3 討論

根系是植物最活躍的養(yǎng)分吸收器官，也是對(duì)逆境脅迫信號(hào)因子最快作出響應(yīng)的器官［17-19］。在鋁、鐵等重金屬離子脅迫下，植物表現(xiàn)的最初癥狀是根尖瓦解，抑制根系伸長，進(jìn)而抑制地上部生長，且在受害程度上根部比地上部更為顯著［20-22］。大量研究結(jié)果也表明，在QTL定位研究中，群體中目標(biāo)性狀的表型變異越大，則遺傳率越高，QTL定位的準(zhǔn)確性越高［23］。因此，本研究選用相對(duì)根長性狀來衡量群體耐Fe2+脅迫的能力。該性狀既可在短期內(nèi)體現(xiàn)各株系在Fe2+脅迫下的表型變異程度，又可消除CSSL群體內(nèi)株系間的自身生長差異，且能簡便測(cè)定和準(zhǔn)確定量，是用來評(píng)價(jià)水稻苗期階段耐Fe2+脅迫的有效指標(biāo)［24］。

本研究共檢測(cè)到Fe2+脅迫下的9個(gè)相對(duì)根長QTL，除qRRL12的加性效應(yīng)值為負(fù)，所在CSSL表現(xiàn)出對(duì)Fe2+脅迫敏感外，其余QTL的加性效應(yīng)值均為正，所在CSSL均表現(xiàn)出比9311更強(qiáng)的耐Fe2+脅迫能力。與已發(fā)表的定位結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)位于水稻第2染色體上的相對(duì)根長QTL qRRL2-2與Fe2+脅迫下控制Fe2+吸收量的標(biāo)記［2］和控制根干重的qRDW2［10］具有相近的染色體位置，而 qRRL2-3與Wan等［7］報(bào)道的Fe2+脅迫下的葉斑指數(shù)QTL位置一致;qRRL6-3與Wan等［7］報(bào)道的Fe2+脅迫下控制主根長的QTL位置一致;qRRL7與Fe2+脅迫下控制抗壞血酸還原酶活性的標(biāo)記［2］和控制相對(duì)地上部干重的qRSW2［10］具有相近的位置。本研究中的qRRL12與 Wan 等［7］利用龍雜 8503/IR64 的 F2/F3群體定位的控制Fe2+脅迫下的株高QTL具有相同的染色體區(qū)間，效應(yīng)卻相反。究其原因可能是雙親遺傳材料或者群體類型不同，也可能是使用了不同的耐性評(píng)價(jià)指標(biāo)或不同的遺傳分析方法而導(dǎo)致的遺傳差異［25］。qRRL2-1、qRRL5、qRRL6-1 和 qRRL6-2 為 4個(gè)新發(fā)現(xiàn)的QTL，尚未見相關(guān)報(bào)道，它們均來源于耐Fe2+脅迫親本日本晴的等位基因，使所在CSSL的耐Fe2+脅迫能力加強(qiáng)。

qRRL2-2、qRRL5和qRRL6-2為本研究中3個(gè)效應(yīng)值較大的QTL，加性效應(yīng)百分率均在20%以上?？梢钥紤]將與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過遺傳重組，應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種或基因聚合育種中，以期培育出高效耐Fe2+脅迫的水稻新品種。本研究的QTL定位結(jié)果將有助于耐Fe2+脅迫等位基因的標(biāo)記輔助選擇，在水稻育種中發(fā)揮作用。

［1］蔡妙珍，林咸永，羅安程，等.過量Fe2+對(duì)水稻生長和某些生理特性的影響［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2002，8(1):96-99.

［2］WU P，HU B，LIAO C Y，et al.Characterization of tissue tolerance to iron by molecular markers in different lines of rice［J］.Plant Soil，1998，203(2):217-226.

［3］WU P，LUO A，ZHU J.Molecular markers links to genes underlying seeding tolerance for ferrous iron toxicity ［J］.Plant Soil，1997，196(2):317-320.

［4］WAN J L，ZHAI H Q，WAN J M，et al.Detection and analysis of QTLs for ferrous iron toxicity tolerance in rice，Oryza sativa L.［J］.Euphytica，2003，131:201-206.

［5］WAN J L，ZHAI H Q，WAN J M，et al.Mapping QTL for traits associated with resistance to ferrous iron toxicity in tice(Oryza sativa L.)，using japonica chromosome segment substitution lines［J］.Acta genetica sinica，2003，30(10):893-898.

［6］WAN J L，ZHAI H Q，WAN J M，et al.Detection and analysis of QTLs associated with resistance to ferrous iron toxicity in rice(Oryza sativa L.)，using recombinant inbred lines［J］.Acta Agronomica Sinica，2004，30(4):329-333.

［7］WAN J L，ZHAI H Q，WAN J M.Mapping of QTLs for ferrous iron toxicity tolerance in rice(Oryza sativa L.)［J］.Acta genetica sinica，2005，32(11):1156-1166.

［8］AKIFUMI S，CORINTA Q G，GLENN B G，et al.QTLs for nutritional contents of rice seedlings(Oryza sativa L.)in solution cultures and its implication to tolerance to iron-toxicity［J］.Plant Soil，2005，275(1-2):57-66.

［9］葉紅霞，李 梅，莊杰云，等.水稻幼苗對(duì)多濃度Fe2+脅迫的QTL聯(lián)合檢測(cè)［J］.分子植物育種，2007，5(1):105-109.

［10］DUFEY I，HAKIZIMANA P，DRAYE X，et al.QTL mapping for biomass and physiological parameters linked to resistance mechanisms to ferrous iron toxicity in rice［J］.Euphytica，2009，167:143-160.

［11］ZHU W Y，LIN J，YANG D W，et al.Development of chromosome segment substitution lines derived from backcross between two sequenced rice cultivars，indica recipient 93-11 and japonica donor Nipponbare［J］.Plant Mol Biol Rep，2009，27:126-131.

［12］趙春芳，周麗慧，于 新，等.基于CSSL的高密度物理圖譜定位水稻分蘗角度QTL［J］.植物學(xué)報(bào)，2012，47(6):594-601.

［13］YOSHIDA S，F(xiàn)ORNO D A，COCK J H，et al.Laboratory manual for physiological studies of rice［M］.3rd ed.Philippines:Int Rice Res Inst Manila，1976:61-64.

［14］ESHED Y，ZAMIR D.An introgression line population of Lycopersicon pennellii in the cultivated tomato enables the identification and fine mapping of yield-associated QTL［J］.Genetics，1995，141:1147-1162.

［15］MCCOUCH S R，CHO Y G，YANO M，et al.Report on QTL nomenclature［J］.Rice Genet Newsl，1997，14:11-13.

［16］PATERSON A H，DEVERNA J W，LANINI B，et al.Fine mapping of quantitative trait loci using selected overlapping recombinant chromosomes in an interspecies cross of tomato［J］.Genetics，1990，124:735-742.

［17］李海波，夏 銘，吳 平.低磷脅迫對(duì)水稻苗期側(cè)根生長及養(yǎng)分吸收的影響［J］.植物學(xué)報(bào)，2001，43(11):1154-1160.

［18］李 鋒，李木英，潘曉華，等.不同水稻品種幼苗適應(yīng)低磷脅迫的根系生理生化特性［J］.中國水稻科學(xué)，2004，18(1):48-52.

［19］明 鳳，米國華，張福鎖，等.發(fā)育時(shí)期對(duì)水稻耐低磷脅迫有關(guān)性狀QTLs檢測(cè)的影響［J］.中國水稻科學(xué)，2011，25(4):443-446.

［20］唐建軍，周建林.水稻耐鐵毒性狀生理指標(biāo)研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)雜志，2001，12(1):159-160.

［21］李德華，陳錦華，賀立源，等.鋁脅迫下玉米根系生理反應(yīng)的基因型差異［J］.孝感學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24(3):5-9.

［22］KOCHIAN L V，PINEROS M A，HOEKENGA O A.The physiology，genetics and molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity［J］.Plant Soil，2005，274:175-195.

［23］汪 斌，蘭 濤，吳為人.鹽脅迫下水稻苗期Na+含量的QTL定位［J］.中國水稻科學(xué)，2007，21(6):585-590.

［24］陳志德，仲維功，王 軍，等.水稻苗期耐Cd2+脅迫的QTL定位研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(3):1-5.

［25］LUO A，JING G，WU P，et al.Ricegenotypes differences in nutrient status under excessive ferric-iron condition［J］.J Plant Nutr，1997，20(10):1361-1374.