NR4A1基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

王良國，黃曉燕，林素，潘嘉林，戴曉春，王本極，吳漪浩，楊德業(yè)

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，溫州醫(yī)學(xué)院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000）

室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）是一種常見的先天性心臟病，但至今對(duì)其致病因素及發(fā)病機(jī)制仍知之甚少。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中起重要作用，骨形態(tài)形成蛋白受體IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPIA又名ALK3）屬于TGF-β超家族，在心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞分化中起重要作用[1-2]。美國Schneider教授創(chuàng)建了心臟特異的ALK3基因敲除的小鼠模型，僅在心臟敲除ALK3基因[3]，發(fā)現(xiàn)純合子小鼠死于胚胎中期，并伴有VSD，心內(nèi)膜墊和肌小梁發(fā)育不全[4]。ALK3基因在調(diào)控心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。楊德業(yè)教授實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片篩選ALK3的下游基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Pax-8在ALK3基因敲除的純合子小鼠胚胎心臟中下調(diào)了7.1倍[5]，周希等[6]已證明Pax-8基因參與了心臟的發(fā)育，并通過抑制心肌細(xì)胞的凋亡而參與胚胎心臟的發(fā)育，而黃曉燕等[7]利用基因芯片檢測小鼠基因表達(dá)水平，篩選出差異表達(dá)的基因，找到了Pax-8的下游基因NR4A1，其受Pax-8基因調(diào)控，在Pax-8保護(hù)細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步研究Pax-8下游基因NR4A1與心肌細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系，本研究通過克隆NR4A1全長序列，構(gòu)建含NR4A1基因的真核表達(dá)載體，為探討NR4A1在心肌細(xì)胞凋亡過程中的功能做準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 Pax-8基因敲除小鼠模型由德國Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠贈(zèng)；Trizol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、DEPC水（RNase-free and DNase-free）及各個(gè)PCR引物均購自Invitrogen公司；FBS、DMEM（low glucose）、0.05%胰酶/EDTA、Hanks均購自Gibco；RT試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）、Dnase I（Rnasefree 1 U/μL）購自MBI Fermantas公司；大鼠H9C2心肌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫；高保真DNA聚合酶Prime STARTM HS DNA Poly-merase購自TAKARA公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；DH5a菌種、超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega；T4連接酶購自Promega；PCR試劑盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix）、封板膜及96孔板購自ABI公司；兔抗鼠NR4A1（NUR77）多克隆抗體購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 Pax-8敲除小鼠的基因型鑒定：用雌性Pax-8 KO+/-（雜合型）小鼠與雄性Pax-8 KO+/-（雜合型）小鼠交配可獲得Pax-8 KO-/-（純合子型）和Pax-8 KO+/-（雜合子型）以及Pax-8 KO+/+（野生型）小鼠。并利用PCR鑒定出Pax-8 KO-/-（純合子型）。引物為5’-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’，5’-GCTAAGAGAAGGT GGATGAGAG-3’，和 5’-GATGCTGCCAGTCTCGTAG-3’。PCR條件：第一步：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性15 s， 60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)。第二步：94 ℃變性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2 NR4A1基因的cDNA克?。河肨RIzol試劑提取Pax-8 KO-/-（純合子型）小鼠心臟組織總RNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，以此為模板，oligo dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)GeneBank中小鼠NR4A1的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游（S1）：5’-ATGCCCTGTATTCAAGCTCAATA-3’，下游（A1）：5’-TCAG AAAGACAATGTGTCCATAA-3’，用高保真DNA聚合酶Prime STARTM HS DNA Polymerase擴(kuò)增NR4A1序列，NR4A1 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性變性5 min后，98 ℃變性10 s，56.4 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)36次，最后延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并回收NR4A1條帶，利用LATaqDNA酶在3’端加上poly A尾，然后與pGEM-T Easy載體連接后，轉(zhuǎn)化到DH5α，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取數(shù)個(gè)陽性克隆菌落搖菌后，測序鑒定，鑒定序列比對(duì)后正確。

1.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d，將1×105/孔細(xì)胞接種至6孔板中，然后按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，用含有10% FBS的DMEM換液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分3組：①實(shí)驗(yàn)組（PZ-NR4A1組）：細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.2μg pIERS2-ZsGreen1-NR4A1重組載體為實(shí)驗(yàn)組；②陰性對(duì)照組（NC組）：細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.2μg pIERS2-ZsGreen1空載體作為陰性對(duì)照組；③空白對(duì)照組（BC組）：給予常規(guī)培養(yǎng)液，未做其他處理。

1.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后NR4A1的mRNA表達(dá)水平：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，然后用RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，NR4A1：上游SSS1：5’-GGGTGACCCCACTATTTGTC’-3’，下游SSA1：5’-CGGAAGAGATCTCGAGTTGG-3’，GAPDH：上游：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游：5’-GGC ATGGACTGTGGTCATGAG-3’。再利用ABI 7500 FAST 型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量檢測。PCR條件：95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行歸一化，各組生物學(xué)重復(fù)三次。數(shù)據(jù)分析利用美國Biosystems公司的Sequence Detec-tion system（SDS）2.2.2軟件進(jìn)行。樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)率（relativeexpression，RQ）采用△△CT方法計(jì)算，RQ＝2-△△CT（CT表示PCR 擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)），△CTsample＝CTsample-CT /GAPDHsample，△CTcontrol＝CTcontrol-CT/GAPDHcontrol，△△CT＝△CTsample-△CTcontrol）

1.2.6 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后NR4A1蛋白表達(dá)水平：轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組上樣30μg，然后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗（NUR77 antibody 1:1000），4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入IgG抗體（1:4000）孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)選擇800通道進(jìn)行掃描條帶，以GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)化NR4A1蛋白質(zhì)表達(dá)，各組技術(shù)、生物學(xué)各重復(fù)三次。用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，獨(dú)立的兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pax-8基因敲除小鼠基因型的鑒定 Pax-8純合子型為約370 bp的條帶，Pax-8雜合型為390 bp和370 bp兩條條帶，Pax-8野生型為約390 bp的條帶。見圖1。

圖1 Pax-8基因敲除小鼠基因型的鑒定

2.2 NR4A1基因的cDNA克隆 從Pax-8基因敲除小鼠中取出心臟組織，提取mRNA后用Fermantas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增后，在1.2%的瓊脂糖凝膠上分離，在1800 bp處可以見到特異性條帶（見圖2），用QIAquick膠回收試劑盒回收后，與pGME-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含X-Gal-IPTG的LB培養(yǎng)板上挑取陽性單克隆，經(jīng)16 h搖菌后，將菌液送至華大基因公司測序，測序結(jié)果與pubmed上公布的NR4A1序列一致。

圖2 NR4A1基因擴(kuò)增

2.3pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表達(dá)載體的初步構(gòu)建 以pGME-T Easy-NR4A1為模板，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后在1.2%的瓊脂糖凝膠上分離，在1800 bp處可以見到明顯特異性條帶（見圖3），與設(shè)計(jì)相符。再次進(jìn)行膠回收，與pIERS2-ZsGreen1載體連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取陽性克隆進(jìn)行快速PCR鑒定，在300 bp左右見到明顯條帶。見圖4。

圖3 NR4A1基因再擴(kuò)增

圖4 NR4A1基因初步鑒定

2.4 NR4A1真核表達(dá)載體的酶切與測序鑒定 將陽性克隆菌液擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI、BamHI進(jìn)行雙酶切后，在瓊脂糖凝膠上分離，預(yù)期切出約1800 bp的NR4A1片段帶和約5.3 kb的載體帶。結(jié)果如圖5所示，與預(yù)期一致。將陽性克隆送到華大基因公司測序，將測序所得的序列和GeneBank中NR4A1基因片段序列進(jìn)行比對(duì)，顯示構(gòu)建序列與預(yù)計(jì)堿基序列一致，因此pIERS2-ZsGreen1-NR4A1構(gòu)建成功。

圖5 pIERS2-ZsGreen1-NR4A1雙酶切

圖6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測NR4A1 mRNA的表達(dá)水平

2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后NR4A1的mRNA表達(dá)水平 與BC組（1.00±0.00）相比，PZ-NR4A1組（2.62±0.21）NR4A1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），與NC組（0.99±0.16）相比，PZ-NR4A1組NR4A1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），而BC組和NC組 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

2.6 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后NR4A1蛋白表達(dá)水平 PZ-NR4A1組（0.72±0.11）與BC組（0.17±0.07）相比，NR4A1的蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），PZ-NR4A1組（0.72±0.11）與NC組（0.21±0.08）相比，NR4A1的蛋白表達(dá)量也明顯升高（P＜0.05），而BC組和NC組相比，NR4A1的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。

圖8 Western blotting法檢測NR4A1蛋白的表達(dá)水平

3 討論

先天性心臟病是由于胎兒時(shí)期心臟血管發(fā)育異常所導(dǎo)致的心血管畸形。其發(fā)病率大約占出生嬰兒的0.8%，研究表明其主要原因可分為遺傳因素和環(huán)境因素兩類，包括染色體易位與基因畸變、大劑量放射性射線接觸、宮內(nèi)感染以及藥物等因素。心臟發(fā)育是一個(gè)既復(fù)雜又連續(xù)的過程，是一系列生長分化因子和轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)的。先天性心臟病輕者無癥狀，在查體時(shí)可被發(fā)現(xiàn)，重者則有紫紺、活動(dòng)后呼吸困難、暈厥等。隨著年齡的增長，可有生長發(fā)育遲緩。 根據(jù)血液動(dòng)力學(xué)以及病理生理的變化，可將先天性心臟病分為三類：①無分流類。②左至右分流類。③右至左分流類。VSD是常見的先天性心臟病，約為先心病總數(shù)30%，而先天性VSD是否與某一特定基因異常有關(guān)，為此楊德業(yè)教授實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片篩選ALK3的下游基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Pax-8，而Pax-8基因參與胚胎心臟的發(fā)育。再利用基因芯片篩選了Pax-8基因敲除小鼠的下游基因，發(fā)現(xiàn)了NR4A1的高表達(dá)。NR4A1又稱Nur77、GFRP1、NGFI-B等，是一種轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族一員，目前未發(fā)現(xiàn)其配體，故又稱為孤兒核受體，從氨基端到羧基端，一共有4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。NR4A1在多種組織中表達(dá)，具有比較復(fù)雜的生物學(xué)功能。NR4A1不僅參與細(xì)胞周期調(diào)控，還與類固醇激素的生成、腫瘤以及動(dòng)脈硬化的形成密切相關(guān)，故NR4A1的作用比較廣泛， 在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、甾體激素合成等諸多方面發(fā)揮作用[8]。其與不同的輔助因子相互作用，可使下游的基因表達(dá)激活或者抑制。國內(nèi)外研究表明，若細(xì)胞受到促進(jìn)生長分裂的分子信號(hào)刺激，NR4A1能調(diào)節(jié)各種促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因表達(dá)；若細(xì)胞受到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子信號(hào)刺激時(shí)，NR4A1通過磷酸化，從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至線粒體，并與Bcl-2相互作用，可使Bcl-2分子由一個(gè)保護(hù)因子變?yōu)闅蜃樱⒂|發(fā)細(xì)胞色素C釋放，而激活細(xì)胞凋亡[9]。在Pax-8基因敲除的小鼠模型中，其心肌細(xì)胞凋亡明顯增高。

NR4A1與Pax-8基因敲除小鼠心肌細(xì)胞的凋亡相關(guān)，在心肌細(xì)胞凋亡的模型中，NR4A1的表達(dá)量明顯升高。由此可以推斷當(dāng)Pax-8基因敲除后，保護(hù)心肌細(xì)胞的因素減弱，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因素增強(qiáng)，從而使NR4A1磷酸化，而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡，繼而出現(xiàn)VSD，導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。我們的研究目的就是想找尋與引起VSD密切相關(guān)的通路，當(dāng)這條通路上的基因被激活或抑制后，心肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)怎樣的生長情況，從而為基因治療先天性心臟病奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建了含NR4A1基因全長的真核表達(dá)載體，并且能在細(xì)胞中成功表達(dá)蛋白，這為進(jìn)一步探索NR4A1的生物學(xué)功能及確定與先天性心臟病的相關(guān)程度奠定了基礎(chǔ)。此外實(shí)驗(yàn)中的真核表達(dá)載體pIERS2-ZsGreen1攜帶有GFP，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率，為之后進(jìn)一步的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究提供了方便。

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