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    三種痰涂片前處理方法的染色及消毒效果評價

    2013-07-27 05:54:04謝愛蓉呂建新
    關(guān)鍵詞:抗酸次氯酸鈉涂片

    謝愛蓉,呂建新

    (溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035)

    結(jié)核病對醫(yī)務(wù)人員的職業(yè)危害不可忽視,實驗室工作人員結(jié)核患病風(fēng)險為普通人群的7~79倍[1]??顾釛U菌涂片鏡檢作為發(fā)現(xiàn)傳染源、選擇化療方案、考核評價療效的重要手段,在現(xiàn)代結(jié)核病控制工作中占有不可或缺的位置。所以在不影響涂片染色鏡檢的情況下,將涂片中的分枝桿菌滅活,對于提高基層實驗室生物安全有重要意義。本實驗利用紫外線照射、次氯酸鈉溶液消毒及高壓蒸汽滅菌三種方法對痰涂片進(jìn)行前處理,用以滅活分枝桿菌,觀察其效果。

    1 材料和方法

    1.1 材料 73份新鮮抗酸染色陽性痰液由溫州市鹿城區(qū)人民醫(yī)院痰檢實驗室提供。次氯酸鈉消毒液、抗酸染色液分別購自杭州西子衛(wèi)生消毒藥械有限公司、杭州嘉偉生物制品有限公司。改良羅氏培養(yǎng)基按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]自制。

    1.2 方法

    1.2.1 痰液處理及分組:痰液充分震蕩勻化,確保細(xì)菌的均勻分布,然后分為四份,分別用于對照組、紫外線照射組、次氯酸鈉溶液消毒組及高壓蒸汽滅菌組。

    1.2.2 各組處理:

    1.2.2.1 對照組:采用直接涂片方式,取40μL痰液在涂片中央處均勻涂抹成10 mm×20 mm的橢圓形痰膜,制作兩張涂片:一張進(jìn)行抗酸染色,作為鏡檢對照;一張經(jīng)火焰固定后刮取痰膜,放入含1 mL 0.9%氯化鈉溶液的試管中浸泡,并加入等體積4% H2SO4,強(qiáng)烈振蕩,靜置20 min后培養(yǎng)。剩余痰液采用分枝桿菌分離培養(yǎng)酸處理方法[2]消化去污,作為培養(yǎng)對照。

    1.2.2.2 紫外線照射組:將涂片置于LABCONCO B2生物安全柜內(nèi),用輻照度值為332~360μw/cm2的紫外燈分別垂直照射(距離58 cm)10、20、40、60、80 min后,同火焰固定培養(yǎng)操作處理,刮取痰膜培養(yǎng)。

    1.2.2.3 次氯酸鈉溶液消毒組:將痰液分為兩小組,向痰液中加入等量有效氯濃度50 g/L次氯酸鈉溶液處理10~15 min后,一組加入等量的蒸餾水混勻,以2500 r/min速度離心15 min,取沉淀;一組加蒸餾水至15 mL混勻,室溫中靜置過夜(15~18 h),取沉淀。

    1.2.2.4 高壓蒸汽滅菌組:將痰液放入高壓蒸汽滅菌鍋中(壓力103.4 kPa,溫度121 ℃),滅菌20 min。以2500 r/min速度離心15 min,取沉淀。

    1.2.3 抗酸染色鏡檢:將處理后的各組痰液,采用對照組涂片方式制作涂片,然后進(jìn)行萋-尼氏抗酸染色及鏡檢分級報告[2]。

    1.2.4 分枝桿菌培養(yǎng)與報告:將處理后的各組痰液,取100μL無菌接種于改良L-J培養(yǎng)基,37 ℃溫箱培養(yǎng),參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]方法觀察并報告結(jié)果。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 使用SPSSl6.0統(tǒng)計學(xué)軟件,采用Friedman M檢驗各組萋-尼染色鏡檢結(jié)果分級差異,然后用Wilcoxon符號秩和檢驗進(jìn)行兩兩比較;logistic回歸分析殺菌效果與痰液含菌量、紫外線照射時間之間的關(guān)系,用x2線性趨勢檢驗菌量與殺菌效果間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 抗酸染色鏡檢比較 各組鏡檢結(jié)果分級存在差異(P<0.05)。73份痰液,對照組結(jié)果為抗酸桿菌陽性(1~8條/300視野)8份,抗酸桿菌陽性(1+)6份,抗酸桿菌陽性(2+)18份,抗酸桿菌陽性(3+)11份,抗酸桿菌陽性(4+)30份。經(jīng)紫外線照射后,鏡檢結(jié)果分級及涂片上結(jié)核菌的染色性、形態(tài)均未發(fā)生改變,與對照組相同。次氯酸鈉溶液消毒組(沉淀法、離心法)鏡檢結(jié)果低于對照組(P<0.05),見表1-2。次氯酸鈉溶液消毒組中沉淀法與離心法鏡檢結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。高壓蒸汽滅菌組鏡檢結(jié)果分級高于對照組(P<0.05),見表4,但其中一張涂片因痰膜脫落,無法鏡檢。在抗酸染色鏡檢效果上,次氯酸鈉溶液消毒組及高壓蒸汽滅菌組鏡下沒有黏液及細(xì)胞的干擾,背景較單一、干凈。

    2.2 分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)對照結(jié)果為涂陽培陽65份,涂陽培陰5份,污染3份。各組分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果比較采用培養(yǎng)對照涂陽培陽的65份樣本。火焰固定后培養(yǎng)結(jié)果與培養(yǎng)對照相同。紫外照射組,隨著紫外線照射時間的延長,培養(yǎng)陰性涂片數(shù)逐漸增多,當(dāng)輻照60 min后,所有涂片分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。經(jīng)logistic檢驗,分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果與涂片含菌量、紫外線照射時間有顯著相關(guān)性,P<0.05,見表5。要達(dá)到殺滅分枝桿菌的目的,菌量越多,培養(yǎng)陰性所需照射時間越長。輻照強(qiáng)度、照射時間相同的情況下,菌量與培養(yǎng)陽性比例存在線性趨勢,P<0.05,見表6,說明菌量越多,培養(yǎng)陽性比例越大,即殺菌效果越差。次氯酸鈉溶液消毒組分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。

    表1 次氯酸鈉溶液沉淀法與對照組抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

    表2 次氯酸鈉溶液離心法與對照組抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

    表3 次氯酸鈉溶液沉淀法與離心法抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

    表4 高壓蒸汽滅菌組與對照組抗酸染色鏡檢結(jié)果分級比較

    表5 不同菌量的涂片經(jīng)紫外線照射不同時間的培養(yǎng)結(jié)果

    表6 不同菌量的涂片照射相同的時間(10 min)后的培養(yǎng)結(jié)果

    3 討論

    本實驗中火焰固定后的涂片培養(yǎng)均為陽性,說明火焰固定并不能殺死涂片上的分枝桿菌。所以涂片在未染色前,應(yīng)進(jìn)行滅活處理,以減少實驗室生物安全危險因素。本實驗采用紫外線照射消毒、次氯酸鈉溶液消毒及高壓蒸汽滅菌三種方法對痰涂片進(jìn)行前處理,用以滅活涂片中的分枝桿菌。

    結(jié)果顯示紫外線照射不影響涂片抗酸染色鏡檢,當(dāng)紫外線輻照劑量達(dá)到1195200~1296000 μw·s/cm2時,培養(yǎng)均為陰性。紫外線照射法其優(yōu)點在于:完好保持了分枝桿菌的抗酸染色特性,而且它不僅殺滅痰膜上的分枝桿菌,也殺滅了制片過程中產(chǎn)生的氣溶膠中的分枝桿菌;該法無需特殊的儀器設(shè)備,也不需要配制試劑,安全、簡便。但是由于紫外線的穿透能力較弱,且其殺菌效果與其輻照強(qiáng)度、照射時間及照射距離密切相關(guān),并受環(huán)境相對濕度影響[3],所以利用生物安全柜中紫外燈照射消毒涂片,涂片應(yīng)均勻涂抹、厚度適宜,不宜過厚,輻照劑量要至少達(dá)到1195200μw·s/cm2。使用中的紫外線燈管應(yīng)定期擦拭清潔,并對其輻照強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測,及時更換燈管,以達(dá)到有效消毒目的。

    本實驗證明有效氯含量為50 g/L的次氯酸鈉溶液,處理痰液10~15 min,可有效殺滅痰液中的分枝桿菌。次氯酸鈉溶液沉淀法與離心法其抗酸染色鏡檢結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與Rasheed等[4]報道相同。但與對照組相比,次氯酸鈉溶液消毒組鏡檢結(jié)果分級降低,并出現(xiàn)高假陰性,與相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]報道一致。次氯酸鈉溶液消毒法其優(yōu)點在于:方法簡便,試劑便宜,且易取得;由于次氯酸鈉消化了痰液中的黏液及細(xì)胞,使得顯微鏡下視野背景單一,更加清晰,提高了閱片的速度;相關(guān)文獻(xiàn)[6]報道次氯酸鈉消毒法敏感性較直接涂片法提高。缺點在于:次氯酸鈉溶液不穩(wěn)定,在使用過程中要注意低溫、避光保存;處理痰液的時間要把握準(zhǔn)確,據(jù)報道稱次氯酸鈉接觸時間過長,會對分枝桿菌造成損傷,當(dāng)時間>60 min時,則可能導(dǎo)致抗酸桿菌的檢出率逐漸降低[5];次氯酸鈉溶液消毒法特異性較傳統(tǒng)直接涂片法有所降低[6]。

    高壓蒸汽滅菌法其涂片鏡檢,鏡下背景干凈、清晰,經(jīng)離心其鏡檢結(jié)果分級高于對照組(P<0.05)。相關(guān)文獻(xiàn)[7]亦報道高壓滅菌后離心痰液,所制成的痰涂片,抗酸桿菌檢出率有效提高。但是本研究發(fā)現(xiàn),痰液經(jīng)高壓滅菌后,由于痰液中的蛋白質(zhì)變性,痰膜較脆弱,在染色過程中易脫落,實驗中有1份樣本由于涂片痰膜徹底脫落,而致無法進(jìn)行隨后的鏡檢工作。高壓滅菌法優(yōu)點在于集菌效果顯著,且消毒徹底,殺滅了一切微生物,大大提高了實驗室生物安全。但是對盛裝痰液的容器有要求,必須為耐高溫、高壓材料;而且實驗室必須配備高壓蒸汽滅菌鍋及適合的離心機(jī);染色時需謹(jǐn)防痰膜脫落。由于處理痰液標(biāo)本需要3 h左右,故此法僅適用于批量處理樣本。

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