XRCC1和XPD多態(tài)性基因型與上皮性卵巢癌鉑類藥物敏感性的關(guān)系

王連云，呂杰強(qiáng)，朱雪瓊，黃秋穗，陳小鳴，夏露，陳文兵

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是致死率最高的婦科惡性腫瘤，目前其標(biāo)準(zhǔn)的治療方法是手術(shù)輔以術(shù)后化療。鉑類藥物是臨床上最常用的一類化療藥物，然而腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性差及至耐藥是導(dǎo)致化療失敗、病情進(jìn)展的主要原因。而DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)是導(dǎo)致EOC鉑類化療敏感性差的主要原因。XRCC1、XPD是DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的重要成員，參與順鉑或卡鉑等鉑類藥物引起的DNA損傷修復(fù)過程。我們通過檢測EOC患者XRCC1和XPD遺傳多態(tài)性基因型，探討XRCC1和XPD多態(tài)性基因型與以鉑類為基礎(chǔ)的EOC化療敏感性之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2008年1月至2011年6月在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦科住院接受初次手術(shù)治療，并經(jīng)手術(shù)病理明確的EOC患者，選擇其中經(jīng)過規(guī)范化治療的患者納入研究，符合納入標(biāo)準(zhǔn)并完整隨訪者共85例，患者年齡27～79歲，平均（56±0.72）歲。85例EOC患者中，漿液性囊腺癌43例，黏液性囊腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣癌11例，其他類型19例，采用2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）的手術(shù)病理分期方法對患者進(jìn)行分期，其中I期18例，II期11例，III期45例，IV期11例。

1.2 手術(shù)方案、范圍 早期（FIGOI～I(xiàn)I期）EOC行全面確定分期的手術(shù)，晚期行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)[1]，經(jīng)過腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后，其中殘留灶直徑＜2 cm 63例，≥2 cm 22例。

1.3 化療方案 所有患者在每一次化療前均常規(guī)檢查血常規(guī)、肝腎功能、心電圖等，并都在正常范圍內(nèi)；功能狀態(tài)KPS評分均＞60分，所有患者均接受以順鉑（DDP）或卡鉑（CBP）為主的化療。其中采用PC方案（DDP/CBP+CTX，CTX：環(huán)磷酰胺）54例（為PC組）；PT方案（DDP+PTX，PTX：紫杉醇）31例（為PT組）。具體用量: DDP 70 mg/m2，靜滴1次，CTX 700 mg/m2，靜注1次；PTX 175 mg/m2靜滴1次，3 h內(nèi)滴完[1]；上述各方案每3～4周重復(fù)。所有患者化療前為保護(hù)腎臟均進(jìn)行水化；化療過程中予雷尼替丁、歐貝、瑞白等藥物對癥處理。

1.4 療效評價(jià) 所有患者完成6個周期的化療后，按照實(shí)體瘤的療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[2]（RECIST Version 1.1）評價(jià)療效。完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶消失；部分緩解（PR）：基線病灶長徑總和縮小≥30%；穩(wěn)定（SD）：基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)部分緩解或有增加但未達(dá)進(jìn)展（PD）；PD：基線病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。對于手術(shù)治療后無實(shí)體瘤監(jiān)測者可按Siddqui等[3]制定的療效標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)：①CR：CA125降至正常，持續(xù)時間＞4周；②PR：CA125下降大于治療前水平的50%，持續(xù)時間＞4周；③SD：CA125下降低于治療前水平的50%，或上升小于治療前的25%；④PD：CA125上升大于治療前的50%。全部患者分為敏感和耐藥。敏感：初次化療近期療效達(dá)CR+PR或者初次治療抑制后6個月以上不進(jìn)展。耐藥：初次化療期間療效有進(jìn)展SD+PD或者6個月內(nèi)復(fù)發(fā)。

1.5 PCR-RFLP方法進(jìn)行基因型分析 所有患者均在化療前抽取靜脈血2 mL，按文獻(xiàn)[4]及GDB數(shù)據(jù)庫的方法進(jìn)行試驗(yàn)，所有引物序列均由上海Sangon公司合成，各基因序列如下：XRCC1 Arg399Gln F：5’-TCCTCCACCTTGTGCTTTCT-3’和R：5’-AGTAGTCTGCT GGCTCTGGG-3’；XPD Lys751Gln F：5’-GCCCGCTCTGGA TTATACG-3’和R：5’-TATCATCTCCTGGCCCCC-3’。25μL PCR混合液中含1μL模板DNA，1μL各引物，12.5 μL 2×Taq MasterMix（天根生化科技北京有限公司），9.5μL ddH2O，Gene Amp 2400 PCR儀為Perkin Elmer公司產(chǎn)品。熱循環(huán)參數(shù)：XRCC1 Arg194Trp基因座：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s、61 ℃30 s、72 ℃ 45 s，共32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。XPD Lys751Gln基因座：94 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。分別取15μL含XRCC1 Arg194Trp和XPD Lys751Gln的PCR產(chǎn)物與限制性核酸內(nèi)切酶NciI和PstI（Fermentas生物試劑公司）37 ℃消化6 h。3.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；對耐藥的相關(guān)因素采用多因素Logistic回歸分析計(jì)算，并對患者年齡、手術(shù)病理分期、手術(shù)情況和化療方案進(jìn)行校正。全部檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療療效 化療6個周期后，85例EOC患者中，CR 22例（占25.9%），PR 32例（占37.6%），SD 17例（占20.0%），PD 14例（占16.5%），根據(jù)化療療效，將全部患者分為化療敏感組和化療不敏感組，總有效率（CR+PR）為63.5%。其中PC方案（DDP/CBP+CTX）54例，PT方案（DDP+PTX）31例，兩種方案有效率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 基因分型

2.2.1 XRCC1 Arg399Gln產(chǎn)物為517 bp，含399Arg/Arg（AA）的PCR產(chǎn)物沒有酶切位點(diǎn)，只有517 bp一個片段；Gln/Gln（GG）經(jīng)NciI酶切后產(chǎn)生384 bp和133 bp2個片段；雜合子Arg/Gln（AG）則含517 bp、384 bp和133 bp三個片段（見圖1-2）。

圖1 XRCC1 PCR電泳圖（M：100 bp Marker；1～5：517 bp產(chǎn)物）

圖2 XRCC1酶切電泳圖（M：100 bp Marker；1，2，4，6，7：GG型；3，8：AG型；5：AA型）

2.2.2 XPDLys751Gln基因擴(kuò)增產(chǎn)物為436 bp，野生基因型Lys/Lys（LL）經(jīng)PstI酶切后產(chǎn)生290 bp和146 bp兩個片段；雜合子Lys/Gln（LG）產(chǎn)生290 bp、227 bp、146 bp和63 bp四個片段；而突變型Gln/Gln（GG）產(chǎn)生227 bp、146 bp和63 bp三條片段基因。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示僅有Lys/Lys（LL）和Lys/Gln（LG）基因型兩個基因型，未發(fā)現(xiàn)Gln/Gln（GG）基因型（見圖3-4）。

圖3 XPD PCR電泳圖（M：100 bp Marker；1～4：436 bp產(chǎn)物）

圖4 XPD酶切電泳圖（M：20 bp Marker；1，2～4：LL型；5：LG型）

2.2.3 85例EOC患者中，XRCC1 Arg399Gln基因Arg/Arg（AA）、Arg/Gln（AG）和Gln/Gln（GG）基因型的分布頻率分別為27.1%（23例）、45.8%（39例）和27.1%（23例）；XPD Lys751Gln基因Lys/Lys（LL）和Lys/Gln（LG）基因型的分布頻率分別為69.4%（59例）和30.6%（26例），沒有發(fā)現(xiàn)Gln/Gln（GG）基因型攜帶者。為保證基因分型的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選26例（占30%）標(biāo)本由另一位操作者進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與第一次完全一致。

2.3 EOC化療的耐藥因素分析

2.3.1 EOC化療的單因素分析：XRCC1 Arg399Gln和XPD Lys751Gln基因型與化療敏感性的關(guān)系：化療敏感組和不敏感組間，XRCC1 Arg399Gln基因AA、AG和GG基因型和XPD Lys751Gln基因LL和LG基因型的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。XRCC1 Arg399Gln基因野生型AA和雜合型AG比較，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雜合型AG與野生型AA相比，化療敏感性增加了5.44倍（P＜0.05，95% CI為1.78～16.65）；純合突變型GG與野生型AA相比，化療敏感性增加了5.31倍（P＜0.05，95% CI為1.50～18.84）。XPD Lys751Gln基因雜合突變型基因型LG和野生基因型LL相比，LL基因型是LG基因型化療敏感性的2.88倍（P＜0.05，95%CI為1.11～7.49）（見表1）。

表1 XRCC1C和XPD基因型與EOC化療敏感性關(guān)系 n（%）

2.3.2EOC化療耐藥的多因素分析：將EOC患者的年齡、手術(shù)病理分期、病理類型、化療方案、殘留灶直徑、XRCC1基因型和XPD基因型納入因變量進(jìn)行多因素的logistic回歸分析（采用FORWARD逐步回歸分析方法），結(jié)果顯示，EOC的殘留灶大小、XRCC1基因型、XPD基因型是與EOC化療耐藥密切相關(guān)的因素（見表2）。

表2 EOC患者化療耐藥的多因素logistic回歸分析

3 討論

鉑類藥物（順鉑、卡鉑、草酸鉑等）是臨床上最常用的一類化療藥物，以鉑類為主的聯(lián)合化療仍是目前EOC的一線化療方案。然而腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性差及至耐藥是導(dǎo)致化療失敗、病情進(jìn)展的主要原因。有關(guān)鉑類藥物耐藥機(jī)制的研究及臨床上腫瘤的預(yù)見性化療一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。近年來在EOC的治療中，化學(xué)治療進(jìn)展較快，各類新藥不斷應(yīng)用于臨床，目前EOC臨床常用的化療方案仍為PC或PT，據(jù)報(bào)道稱其總有效率（CR+PR）為70%左右[5]，本研究結(jié)果為66.7%，與之相近。但PC組與PT組療效相比，有人認(rèn)為，PT組優(yōu)于PC組[5]，但本研究結(jié)果顯示兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與標(biāo)本選取及標(biāo)本例數(shù)有關(guān)。

XRCC1是參與堿基切除修復(fù)且與鉑類藥物抵抗有關(guān)的重要因子，參與DDP或CBP引起的損傷修復(fù)。目前的研究發(fā)現(xiàn)XRCC1基因有3個多態(tài)性位點(diǎn)：C26304T、G27466A、G28152A；分別引起蛋白質(zhì)Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln的改變。其中Arg399Gln 位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)與PARP（poly AD Pribose polymerase）結(jié)合的功能區(qū)內(nèi)，因而推測可能對蛋白功能的影響較大。通過基因與腫瘤易感性的研究顯示，XRCC1基因多態(tài)性與肺癌、胃癌、大腸癌、食管癌等多種腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[6-8]，這些結(jié)果均間接證明XRCC1多態(tài)性可能影響DNA的修復(fù)能力。王中華等[9]在研究XRCC1基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）對鉑類化療藥物敏感性時認(rèn)為194位點(diǎn)Trp/Arg或Trp/Trp型比Arg/Arg型的療效要好，較易緩解腫瘤負(fù)荷。Fernet等[10]的研究也認(rèn)為XRCC1基因的多態(tài)性與患者對放化療的敏感性有關(guān)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)XRCC1 Arg399Gln的基因多態(tài)性與EOC患者鉑類為主化療的敏感性存在相關(guān)性，以攜帶XRCC1Gln/Gln基因型患者對化療的敏感性最高，而攜帶XRCC1Arg/Arg基因型患者的敏感性最差。但也有研究認(rèn)為XRCC1的單核苷酸多態(tài)性與腫瘤的易感性或治療的敏感性無關(guān)[11]。可能與基因在不同組織中的表達(dá)不同，或不同的種族人群差異有關(guān)。

XPD基因是著色性干皮?。▁eroderma pigmentosum，XP）7個互補(bǔ)組即XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG中的一個組分。它編碼一種DNA解螺旋酶，此基因是多級的NER途徑中的重要一環(huán)，而NER途徑負(fù)責(zé)修復(fù)大部分的鉑-DNA雜合物，去除與大量雜合物相連的DNA片段及DNA片段的再生。蔣易等[12]報(bào)道，通過構(gòu)建XPD反義表達(dá)質(zhì)粒并導(dǎo)入具有正常NER途徑功能的人肺腺癌細(xì)胞株A549中，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞XPD表達(dá)水平來探討其對細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力及抗腫瘤藥物的耐藥性，結(jié)果表明XPD反義RNA能降低肺癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力，從而驗(yàn)證了XPD在細(xì)胞核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)中的重要作用。目前XPD多態(tài)與腫瘤易感性的研究很多，所涉及的腫瘤主要有肺癌、食管癌、皮膚癌、頭頸部腫瘤、結(jié)直腸癌和膀胱癌等，研究結(jié)果[13-15]不盡相同。Arienti等[16]通過實(shí)驗(yàn)證明XPD基因多態(tài)性與EOC鉑類化療的耐藥存在著明顯的關(guān)系。我們初步探討了XPD Lys751Gln基因與EOC鉑類化療敏感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，XPD Lys751Gln基因與EOC鉑類化療敏感性存在相關(guān)性。但我們未發(fā)現(xiàn)XPD Lys751Gln基因Gln/Gln（GG）基因型存在，考慮可能與樣本含量及不同地區(qū)的人群有關(guān)，有待于多中心大樣本進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示XRCC1 Arg399Gln和XPD Lys751Gln基因型與EOC鉑類藥物化療的敏感性有關(guān)。XRCC1 Arg399Gln和XPD Lys751Gln單核苷酸多態(tài)性基因型有可能作為檢測指標(biāo)來預(yù)測EOC鉑類藥物的化療效果，用于指導(dǎo)該類藥物的個體化使用，以提高臨床治療的針對性和可預(yù)見性，從而實(shí)現(xiàn)EOC的個體化治療。

[1] 豐有吉, 沈鏗. 婦產(chǎn)科學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2008:335-338.

[2] Nishino M, Jagannathan JP, Ramaiya NH, et al. Revised RECIST guideline version 1.1:what oncologists want to know and what radiologists need to know[J]. Roentgenol, 2010,195(2):281-289.

[3] Siddiqui N, Boddy AV, Thomas HD, et al. A clinical and pharmacokinetic study of the combination of carboplatin and paclitaxel for epithelial ovarian cancer[J]. Br J Cancer,1997, 75(2):287-294.

[4] Xing D, Qi J, Miao X, et al. Polymorphisms of DNA repair genes XRCC1 and XPD and their associations with risk of esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population[J]. Cancer, 2002, 100(5):600-605.

[5] 張穎, 王建, 王東, 等. 紫杉醇加鉑類和環(huán)磷酰胺加鉑類方案對卵巢上皮性癌療效[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 9(1):66-68.

[6] 張克, 梁軍, 呂紅英, 等. 晚期大腸癌患者血清XRCC1基因多態(tài)性與奧沙利鉑化療療效相關(guān)性的研究[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2008, 15(11):832-835.

[7] 黃朝暉, 華東, 李莉華, 等. XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性對接受鉑類藥物化療胃癌患者預(yù)后的影響[J]. 腫瘤, 2008, 28(3):242-245.

[8] Huang ZH, Hua D, Du X, et al. Polymorphisms in p53,GSTP1 and XRCC1 predict relapse and survival of gastric cancerpatients treated with oxaliplatin-based adjuvant chemotherapy[J]. Cancer Chemother Pharma-co, 2009, 64(5):1001-1007.

[9] 王中華, 繆小平, 譚文, 等. XRCC1單核苷酸多態(tài)與晚期非小細(xì)胞肺癌對鉑類藥物化療敏感性的相關(guān)性[J]. 癌癥, 2004,23(8):865-868.

[10]Fernet M, Hall J. Genetic biomarkers of therapeutic radiation sensitivity[J]. DNA Repair(Amst), 2004, 3(8-9):1237-1243.

[11]Krupa R, Kasznicki J, Gajecka M, et al. Polymorphisms of the DNA repair genes XRCC1 and ERCC4 are not associated with smoking- and drinking-dependent larynx cancer in a Polish population[J]. Exp Oncol, 2011, 33(1):55-56.

[12] 蔣易, 周李承, 吳曉明, 等. 核苷酸切除修復(fù)基因XPD反義RNA表達(dá)載體的構(gòu)建及功能研究[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào),2003, 32(3):242-245.

[13]Wu W, Li H, Wang H, et al. Effect of polymorphisms in XPD on clinical outcomes of platinumbased chemotherapy for Chinese non-small cell lung cancer patients[J]. PLoS One, 2012, 7(3):e33200.

[14]Yuan L, Cui D, Zhao EJ, et al. XPD Lys751Gln polymorphism and esophageal cancer risk:A meta-analysis involving 2288 cases and 4096 controls[J]. World J Gastroenterol,2011, 17(18):2343-2348.

[15]Ji YB, Tae K, Lee YS, et al. XPD Polymorphisms and Risk of Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck in a Korean Sample[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol, 2010, 3(1):42-47.

[16]Arienti C, Tesei A, Verdecchia GM, et al. Peritoneal carcinomatosis from ovarian cancer:chemosensitivity test and tissue markers as predictors of response to chemotherapy[J]. J Transl Med, 2011, 9:94.