結核分枝桿菌休眠相關抗原Rv1733c DNA疫苗的構建及免疫學特性研究

段安虎 張薇 柏銀蘭 康健 王瑞 徐志凱 王麗梅

·論 著 ·

結核分枝桿菌休眠相關抗原Rv1733c DNA疫苗的構建及免疫學特性研究

段安虎 張薇 柏銀蘭 康健 王瑞 徐志凱 王麗梅

目的 構建結核分枝桿菌（Mtb）休眠相關抗原Rv1733c的真核表達載體，并評價其作為DNA疫苗的免疫學特性。方法 利用限制性酶切的方法從本室前期保存的p MD-18T-Rv1733c質粒中構建Rv1733c的真核表達載體pcDNA-Rv1733c。將pcDNA-Rv1733c重組質粒穩(wěn)定轉染P815細胞，并用間接免疫熒光法檢測Rv1733c的表達。采用數字表法隨機將BALB/c小鼠分為3組，每組10只，即pcDNA-Rv1733c質粒DNA組、生理鹽水組和BCG組。pcDNA-Rv1733c質粒DNA組和生理鹽水組采用肌內注射方式免疫，間隔2周免疫1次，共免疫3次。BCG組采用皮下免疫一次。各組小鼠每2周采血，ELISA檢測血清中特異性抗體水平和IgG2a/IgG1抗體亞類比率與比值。初次免疫8周后，MTS［3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt］（四氮唑藍鹽化合物）法檢測小鼠脾淋巴細胞特異性增殖、ELISPOT檢測脾淋巴細胞分泌IFN-γ的水平。流式細胞法檢測脾淋巴細胞中CD4+和CD8+T細胞所占比率；LDH法檢測CTL（cytotoxic T lymphocytes；細胞毒性T淋巴細胞）活性。結果 成功構建Rv1733c的真核表達載體pcDNA-Rv1733c。間接免疫熒光實驗表明pcDNA-Rv1733c質粒穩(wěn)定轉染的P815細胞中能夠穩(wěn)定表達Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c質粒DNA免疫小鼠后能誘導小鼠產生特異性抗體，抗體亞類以IgG2a為主，隨著免疫時間的延長，IgG2a/IgG1的比值趨于平衡；脾淋巴細胞增殖指數（2.00±0.36）高于BCG組（1.1±0.06）（t=3.096，P＜0.05）；特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞頻數（41.48±5.30）SFC/106高于生理鹽水組（2.75±1.37）SFC/106（t=4.752，P＜0.05）；然而脾淋巴細胞中CD4+、CD8+T細胞所占比率［分別為（18.15±2.30）%、（7.68±1.34）%］、CTL殺傷活性［（29.52± 1.96）%］都與生理鹽水組相當［（16.43±2.02）%（t=0.571，P＞0.05）、（7.32±0.42）%（t=0.234，P＞0.05）、（25.28±2.51）%（t=0.726，P＞0.05）］。結論 成功構建Rv1733c真核表達載體pcDNA-Rv1733c；并能夠誘導小鼠機體產生特異性的體液和細胞免疫應答，提示用于結核病新型疫苗的研究具有一定的意義。

分枝桿菌，結核； 抗原，細菌； 疫苗，DNA； 抗體生成； 免疫，細胞

目前結核病（tuberculosis，TB）嚴重威脅著人類健康。全球約1/3人口潛伏感染結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），其中5%～10%有可能發(fā)展為TB，控制Mtb潛伏感染對于TB防治具有重要意義［1］。研究表明，Mtb在潛伏感染期主要以休眠菌狀態(tài)存在。Mtb休眠菌為了適應宿主環(huán)境和逃避機體免疫作用而特異性轉錄表達一組由休眠調節(jié)子DosR（dormancy regulon）調控的休眠相關抗原（1atency antigens），共48個［2-3］。休眠相關抗原的表達對Mtb在體內的潛伏感染和持續(xù)存活具有重要意義。Leyten等［4］研究發(fā)現，在Mtb潛伏感染人群中可檢測到針對休眠相關抗原的特異性免疫應答，而在BCG免疫人群中未能檢測到［5］，因此認為以Mtb休眠相關抗原作為靶抗原設計疫苗，可能獲得針對Mtb潛伏感染的保護性免疫應答，有助于清除Mtb休眠菌，防止TB復發(fā)。休眠相關抗原Rv1733c是Mtb潛伏感染人群中外周血T淋巴細胞識別率較高的一個蛋白，該蛋白能夠有效刺激T淋巴細胞分泌IFN-γ［6］。因此，本研究構建了Rv1733c的真核表達載體，并檢測其免疫小鼠后的免疫學特性，為TB新型疫苗候選抗原的研究奠定基礎。

材料和方法

一、材料

1.試劑和耗材：真核表達載體pcDNA3.1（-）、E.coli DH5α菌株、P815細胞（小鼠肥大瘤細胞，H-2 d）保存；重組質粒p MD-18T-Rv1733c由本室前期構建和保存［7］。限制性內切酶、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa生物公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；G418購自Roche公司；質粒大量提取試劑盒購自Omega公司；CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity檢測試劑盒購自Promega公司；大鼠抗小鼠CD4：FITC/CD8：RPE-Dual Reagent購自AbD Serotec公司；FITC標記-羊抗小鼠IgG購自北京中杉生物公司；純化的Rv1733c蛋白和Rv1733c蛋白免疫小鼠血清由本室前期制備保存［7］。

2.實驗動物：BALB/c雄性小鼠，6～8周齡，18～20 g/只，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

二、方法

（一）pcDNA-Rv1733c重組質粒的制備

1.真核表達載體的構建：以Bam HⅠ和Hin dⅢ分別雙酶切pcDNA3.1（-）載體以及重組質粒p MD-18T-Rv1733c，分別回收載體片段和各目的基因片段。將回收的目的基因片段與經雙酶切后的真核表達載體pcDNA3.1（-）分別進行連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞。并分別接種于5 ml含100μg/ml氨芐青霉素的溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后提取質粒，以Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切鑒定。陽性克隆命名為pcDNARv1733c。

2.G418濃度的篩選和細胞轉染：用24孔板中加入P815細胞，于24 h后加入G418篩選，5% CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)8～10 d，觀察P815細胞死亡情況，選取稍高于細胞全部死亡孔的 G418濃度為工作濃度。細胞轉染前1 d于24孔板中每孔接種2× 105個P815細胞，采用Lipofectamine 2000將pcDNA-Rv1733c和pcDNA3.1（-）兩種質粒分別轉染P815細胞，轉染后24 h，將細胞按1∶10體積稀釋，分別加入G418抗生素，后再繼續(xù)培養(yǎng)7 d。用間接免疫熒光法（IFT）檢測目的基因表達的相應抗原。選取陽性細胞進行克隆化后擴大培養(yǎng)。

3.IFT檢測轉染細胞中目的蛋白的表達：將轉染后的細胞株接種于24孔板中，24 h后進行IFT檢測細胞株是否表達目的蛋白。PBS緩沖液輕柔洗滌細胞3次，加入預冷的甲醇，-20℃固定15 min，再以PBS洗滌3次，山羊血清封閉30 min，PBS洗滌3次。加入抗Rv1733c蛋白免疫小鼠血清（由本實驗室前期制備保存［7］），4℃過夜。次日以PBS洗滌后加入1∶2000稀釋的異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育2 h后以PBS洗滌并于熒光顯微鏡下觀察。

4.重組質粒的大量提取：將pcDNA-Rv1733c重組質粒的陽性克隆分別接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100μg/ml），37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日擴大培養(yǎng)12 h。質粒的大量提取及純化按照試劑盒說明書進行。

（二）動物分組及免疫

BALB/c小鼠數字表法隨機分為3組，pcDNARv1733c質粒DNA組、生理鹽水組和BCG組，每組10只。各組小鼠免疫前24 h在小鼠后肢大腿兩側多點肌注0.25%鹽酸布比卡因50μl。其中pcDNA-Rv1733c質粒DNA組和生理鹽水組采用肌內注射方式免疫，分別為pcDNA-Rv1733c質粒DNA 100μg/只和生理鹽水0.1 ml/只；兩組小鼠以同樣的方法每隔2周免疫1次，共免疫3次。BCG組每只小鼠皮下接種BCG 1×105CFU/0.1 ml，免疫1次。

（三）免疫小鼠的免疫學特性的檢測

1.特異性抗體及抗體亞型的檢測：各組小鼠每2周尾靜脈采小鼠血，分離血清。用純化的Rv1733c蛋白（由本室自備保存）以10μg/ml的濃度包被ELISA板，100μl/孔，4℃過夜。PBS洗滌3次，加入5%牛血清白蛋白（BSA）100μl/孔，37℃封閉1 h。PBS洗滌3次后加入不同倍比稀釋度的小鼠血清100μl/孔，37℃孵育1 h；PBS洗滌3次后加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-羊抗小鼠IgG 100μl/孔，37℃孵育1 h；PBS洗滌3次后加入底物［鄰苯二胺（OPD）］顯色液100μl/孔，37℃反應10 min，再加入2 mol H2SO4終止液，測定A490nm值。以正常小鼠血清為陰性對照，實驗組/對照組≥2.1時判為陽性。

BCG組以PPD包被的ELISA板檢測抗體效價及抗體亞型。檢測抗體的IgG2a/IgG1亞型時，所有待測血清均以1∶100稀釋，二抗則分別為1∶4000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG2a或HRP-羊抗小鼠IgG1。其余步驟同抗體效價的測定。

2.脾淋巴細胞的分離制備：免疫結束后4周，將小鼠頸部脫臼處死，無菌取脾臟，置于200目銅網上，以注射器針芯研磨，加入Hanks液2 ml沖洗。將上述細胞懸液緩慢加入4 ml的小鼠脾淋巴細胞分離液上，8000×g離心20 min。吸取中間的白膜層（單個核細胞層），用RPMI-1640液洗滌2次后，計數備用。

3.脾淋巴細胞的增殖實驗：用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將分離的各組小鼠脾淋巴細胞濃度調整至5×105/ml，在96孔板中培養(yǎng)，200μl/孔。pcDNARv1733c質粒DNA組的抗原刺激組（實驗孔）每孔加入50μl純化的Rv1733c蛋白（50 mg/L溶于RPMI-1640培養(yǎng)液）刺激，BCG組實驗孔加入50μl的PPD（25 mg/L）刺激，生理鹽水組實驗孔加入純化的Rv1733c蛋白，所有組的陰性對照孔均不加蛋白刺激，調零孔不加脾淋巴細胞，各孔均設3個復孔。37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)68 h后，加MTS［3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt］（四氮唑藍鹽化合物）20μl/孔（5 mg/ml，溶于PBS，p H值為7.2，過濾除菌），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，加10%十二烷基硫酸鈉（SDS）25μl/孔，測定A490nm值。

4.脾淋巴細胞分泌IFN-γ的ELISPOT檢測：IFN-γ檢測的ELISPOT 96孔板為預包被板，不需特殊處理，于實驗當日以無菌PBS 200μl/孔洗滌4次，10%胎牛血清（FCS）RPMI-1640培養(yǎng)液200 μl/孔，室溫孵育封閉30 min后即可用于檢測。將計數好的細胞懸液調整為5×106/ml，按100μl/孔的量分別加入到96孔板中，每個處理做2個復孔。在96孔板中同時加入50μl刺激物，并于37℃孵箱孵育，其中特異性刺激蛋白Rv1733c和PPD終濃度為25μg/ml，非特異刺激物ConA的終濃度為5μg/ml，陰性對照加入10%FCS RPMI-1640培養(yǎng)液50μl/孔。將96孔板置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育48 h后以4℃的去離子水裂解細胞，PBS 200μl/孔洗滌平板4次。加入以0.5%FCS PBS稀釋的生物素標記抗體（R4-6A2-biotin）1μg/ml，100μl/孔，室溫孵育2 h。PBS洗滌3次后加入含0.5%FCS的PBS所稀釋的Streptavidin-ALP（1∶1000），100μl/孔，室溫孵育1 h。PBS洗滌后加入BCIP底物液，底物使用前用直徑0.45μm濾器濾除雜質，100μl/孔，顯色直至有清晰斑點出現，清水輕柔沖洗96孔板正反兩面；避光晾干，斑點計數。

5.脾淋巴細胞CD4+T細胞/CD8+T細胞計數：取100μl細胞濃度為1×105/ml各組小鼠脾淋巴細胞，加入熒光標記的CD4：FITC/CD8：RPE單抗10μl，充分混勻于室溫避光孵育染色30 min。8000×g離心20 min，洗滌液洗滌2次，棄上清，加入終濃度2%的多聚甲醛固定液500μl重懸細胞，流式細胞儀檢測。

6.脾淋巴細胞特異性細胞毒性 T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）活性檢測：CTL檢測采用乳酸脫氫酶（LDH）方法。以上述方法中制備的pcDNA-Rv1733c重組質粒轉染P815細胞的穩(wěn)定表達系作為靶細胞，以本室前期保存的P815-Hsp65穩(wěn)定轉染細胞系作為測定BCG免疫小鼠脾淋巴細胞CTL活性的靶細胞。以各組小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞。具體實驗步驟參見Promega公司的CTL檢測試劑盒說明書。

（四）統(tǒng)計學分析

結 果

一、pcDNA-Rv1733c重組質粒制備的結果

1.Rv1733c真核表達載體的構建：采用限制性酶切的方法將Rv1733c目的基因從質粒p MD-18TRv1733c中亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1（-）中，并進行酶切鑒定，結果表明，所構建的重組載體能夠特異性切出大小為633 bp的基因片段，與預期大小一致，表明成功構建了Rv1733c基因的真核表達載體，陽性克隆命名為pcDNA-Rv1733c（圖1）。

M：DNA分子量標準；1：pcDNA-Rv1733c質粒的雙酶切產物圖1 pcDNA-Rv1733c的酶切鑒定

2.pcDNA-Rv1733c穩(wěn)定轉染P815細胞系的建立：結果如圖2所示，在pcDNA-Rv1733c穩(wěn)定轉染的P815細胞胞質中可見到有較強的特異性免疫熒光；而未轉染的空白P815細胞中，整個細胞全部被Evans blue染成紅色，沒有特異性綠色熒光出現。表明所篩選的pcDNA-Rv1733c質粒轉染P815細胞系可穩(wěn)定表達Rv1733c蛋白。

二、免疫小鼠的免疫學特性檢測結果

（一）特異性抗體及其亞型的比例檢測

圖2 pcDNA-Rv1733c穩(wěn)定轉染P815細胞系中的Rv1733c的IFT檢測

1.ELISA法檢測各組小鼠的特異性抗體水平：pcDNA-Rv1733c質粒DNA組小鼠的抗體效價均隨著免疫時間及次數的增加持續(xù)增高，在第3次免疫后2周左右抗體水平達到最高，效價為1∶1600，但抗體水平（A492=0.67±0.13）低于BCG免疫組小鼠的抗體水平（A492=0.91±0.05）（t=3.184，P＜0.05）（圖3）。

圖3 免疫小鼠血清抗體水平

2.ELISA法檢測小鼠抗體亞型IgG2a/IgG1的比值：pcDNA-Rv1733c質粒DNA組和BCG組小鼠在初次免疫后2周抗體亞型均以IgG2a為主，此后隨免疫次數及免疫時間的延長，IgG2a逐漸降低，IgG1逐漸增高，二者逐漸達到一個平衡的狀態(tài)（圖4）。

圖4 小鼠體內抗體亞型IgG2a/IgG1的比值分析

（二）脾淋巴細胞的免疫學特性檢測結果

1.MTS法檢測各組小鼠的脾淋巴細胞特異性增殖：結果表明，pcDNA-Rv1733c質粒DNA組小鼠脾淋巴細胞在Rv1733c蛋白的特異性刺激下可發(fā)生特異性增殖，增殖指數（SI）為（2.00±0.36），高于BCG組小鼠脾淋巴細胞在Rv1733c蛋白刺激下的SI（1.1±0.06）（t=3.096，P＜0.05），但低于PPD蛋白刺激下的BCG組小鼠脾淋巴細胞SI（2.6± 0.17）（t=4.154，P＜0.05）（圖5）。

圖5 小鼠脾淋巴細胞的特異性增殖實驗

2.ELISPOT法檢測各組小鼠脾淋巴細胞特異性分泌IFN-γ的水平：pcDNA-Rv1733c質粒DNA組小鼠脾淋巴細胞特異性分泌IFN-γ的細胞頻數［斑點形成細胞（spot forming cells，SFC）］為（41.48± 5.30）SFC/106，高于生理鹽水組的（2.75±1.37）SFC/106（t=4.752，P＜0.05）和Rv1733c蛋白刺激下的BCG免疫組小鼠的（7.25±2.82）SFC/106（t= 3.151，P＜0.05），但明顯低于PPD蛋白刺激下的BCG免疫組小鼠的IFN-γ細胞頻數（104.25± 6.72）SFC/106（t=5.841，P＜0.01）（圖6）。

圖6 ELISPOT檢測各組小鼠特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞頻數

3.流式細胞儀檢測各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+T細胞所占比率（%）：結果如圖7所示，pcDNA-Rv1733c質粒DNA組小鼠脾淋巴細胞中CD4+和CD8+T細胞所占比率分別為（18.15± 2.30）%和（7.68±1.34）%，低于BCG組小鼠的各類細胞所占比率［（35.82±1.79）%（t=3.571，P＜0.05）和（18.82±0.79）%（t=2.864，P＜0.05）］，與生理鹽水組相比差異無統(tǒng)計學意義［（16.43±2.02）%（t=0.571，P＞0.05）和（7.32± 0.42）%（t=0.234，P＞0.05）］。

圖7 小鼠脾淋巴細胞中CD4+T和CD8+T細胞所占比率

4.LDH法檢測各組小鼠脾淋巴細胞的CTL殺傷效應：結果如圖8所示，當效靶比為100∶1時，pcDNA-Rv1733c質粒DNA組小鼠脾淋巴細胞的CTL殺傷活性為（29.52±1.96）%，低于BCG誘導的小鼠脾淋巴細胞CTL殺傷活性（51.56± 2.93）%（t=4.234，P＜0.05），與生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學意義（25.28±2.51）%（t=0.726，P＞0.05）。

圖8 小鼠脾淋巴細胞CTL殺傷活性

討 論

結核病DNA疫苗不僅可以作為治療性疫苗，也可以作為預防性疫苗的加強型疫苗［8］。其中最重要的是其不僅可以誘導針對相應抗原的體液免疫應答，還可以產生持久的Th1細胞免疫應答。Th1型CD4+T細胞可以分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子發(fā)揮保護性免疫應答，CD4+T細胞可以直接識別并殺傷表達相應抗原的靶細胞，并通過分泌IFN-γ等達到抗Mtb感染的免疫保護效應。因此特異性的CTL應答，對于識別、殺傷和清除寄生于巨噬細胞內的Mtb非常有意義，也是一個良好的防治TB新型疫苗所必需的［9］。

研究發(fā)現Mtb在潛伏感染期主要以休眠菌狀態(tài)存在，Mtb休眠菌可特異性表達與其休眠相關的抗原，這些抗原對Mtb在體內的潛伏感染和持續(xù)存活具有重要意義。Rv1733c是TB患者外周血T細胞能夠識別較強的一個 Mtb休眠相關抗原，且該抗原能夠明顯刺激TB患者T淋巴細胞釋放IFN-γ。因此，本研究構建了Rv1733c的真核表達載體，并評價其作為DNA疫苗的免疫學特性。實驗結果顯示，將構建的真核表達載體pcDNA-Rv1733c轉染到P815細胞后，經G418的克隆化篩選，轉染的P815細胞胞質內能夠利用Rv1733c蛋白免疫小鼠血清穩(wěn)定檢測到Rv1733c蛋白的表達，表明Rv1733c的真核表達載體構建成功。

將pcDNA-Rv1733c重組質粒DNA免疫小鼠，檢測免疫小鼠的體液和細胞免疫應答。實驗結果顯示Rv1733c的DNA疫苗在免疫小鼠后第2周起即可檢測到Rv1733c的特異性抗體，且抗體水平隨免疫次數的增加及時間延長而增高，并在第3次免疫后2周抗體水平達到最高，效價為1∶1600，但Rv1733c的DNA疫苗免疫小鼠產生的抗體水平低于BCG免疫組小鼠的抗體水平（P＜0.05）?？贵w亞類檢測結果表明，DNA疫苗和BCG免疫小鼠血清中IgG2a和IgG1的抗體亞類均是在免疫初始以IgG2a為主（Th1型免疫應答的特異性標志之一），但隨著免疫時間延長，IgG2a水平逐漸下降，并趨于IgG2a/IgG1平衡的狀態(tài)。上述結果說明Rv1733c 的DNA疫苗在小鼠體內能夠刺激產生特異性體液免疫應答，但免疫原性較弱，且刺激產生的Th1型免疫反應不持久，免疫原性不及BCG。

免疫小鼠的細胞免疫應答檢測結果顯示，與生理鹽水對照組相比，Rv1733c的DNA疫苗免疫小鼠的脾淋巴細胞經Rv1733c抗原特異性刺激后能夠發(fā)生明顯的特異性的淋巴細胞增殖（P＜0.05），特異性分泌IFN-γ的水平高于生理鹽水組（P＜0.05），但脾淋巴細胞中的CD4+和CD8+T細胞的百分比、CTL的特異性殺傷活性均與生理鹽水組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明Rv1733c的DNA疫苗在小鼠體內雖能刺激產生細胞免疫應答，但細胞免疫應答并不強烈。然而值得注意的是，BCG免疫組小鼠各項細胞免疫應答指標雖均高于Rv1733c的DNA疫苗免疫小鼠（P＜0.05），然而BCG免疫組小鼠的脾淋巴細胞在Rv1733c抗原的特異性刺激下并無特異性反應，與生理鹽水組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明BCG免疫過程中并不能誘導機體產生針對 Mtb休眠相關抗原Rv1733c特異性免疫反應，此結果與文獻報道相一致［5］，再次說明BCG保護效果不理想的可能原因之一是無法誘導機體產生針對Mtb休眠相關抗原保護性免疫反應。前期多篇文獻報道表明在持續(xù)感染小鼠模型及持續(xù)感染人群中，Rv1733c是Mtb休眠相關抗原中能被識別最高頻率的一個抗原，且可引起相應的強烈的T細胞免疫應答［10］，然而本實驗中Rv1733c DNA疫苗誘導的細胞免疫應答相對較弱，分析其中原因，可能與免疫途徑、佐劑以及實驗動物等諸多因素相關。Bivas-Benita［11］等的實驗也正好表明了這一點，作者通過改變免疫途徑以及免疫佐劑，可以有效提高Rv1733c的質粒DNA的細胞免疫應答，取得較好的結果。這也從另一方面表明，免疫途徑、免疫佐劑等免疫策略對DNA疫苗免疫效果的影響是十分重要的。

結核病既是感染性疾病，又是一種免疫性疾病，疫苗用于結核病的免疫治療是一個新的探索領域。Mtb休眠菌是Mtb在體內持留存在，化療藥物難以清除的主要原因，并成為結核病復發(fā)和傳染的主要來源。因此，對 Mtb休眠相關抗原的免疫學特性的深入研究，對于控制 Mtb的潛伏感染、預防發(fā)病及其用于結核病的免疫治療中均具有重要研究意義。

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Construction and immunogenicity of the DNA vaccine of dormancy related antigen Rv1733c of Mycobacterium tuberculosis

DUAN An-hu*，ZHANG Wei，BAI Yin-lan，KANG Jian，WANG Rui，XU Zhi-lai，WANG Li-mei.*Shaanxi Research Institute for Tuberculosis Prevention and Control，Xi'an 710048，China

WANG Li-mei，Email：limwang@tom.com

Objective To construct DNA vaccine of dormancy related antigen Rv1733c of Mycobacterium tuberculosis（Mtb），and to evaluate its immunogenicity in mice.Methods Rv1733c gene was cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA 3.1（-）from the plamid p MD-18T-Rv1733c，which was constructed previously and preserved in our lab.The constructed plasmid was named pcDNA-Rv1733c.P815 cells were stably transfected with the plasmid pcDNA-Rv1733c，and were detected the protein expression of Rv1733c by indirect immunofluorescence （IFT）.The mice BALB/c were divided randomly into three groups named pcDNA-Rv1733c DNA，saline and BCG，10 mice per group.The mice were immunized with pcDNA-Rv1733c DNA or saline intramuscularly 3 times at an interval of 2 weeks.BCG was immunized subcutaneously only once.The antigen specific antibody level and IgG2a/ IgG1 subtype ratio in immunized mice were detected by ELISA every 2 weeks.At 8 weeks after the first immunization，the specific proliferation of spleno-lymphocytes of mice was detected by MTS［3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt］method，and IFN-γsecreted by splenolymphocytes was detected by ELISPOT.The percentages of CD4+and CD8+T cells in spleno-lymphocytes were analyzed by flow cytometry，and the function of cytotoxicity T lymphocyte（CTL）was detected by lactate dehydrogen-ase（LDH）assay.Results The eukaryotic expression plasmid of Rv1733c gene was successfully constructed，named pcDNA-Rv1733c.In P815 cells stably transfected with pcDNA-Rv1733c plasmid，the expression protein of Rv1733c could be stably detected by IFT.In immunized mice，the pcDNA-Rv1733c plasmid could stimulate the production of the antigen specific antibody，and the antibody subtype biased to IgG2a，but with the extension of immunization time，the ratio of IgG2a/IgG1 was tended to balance.In pcDNA-Rv1733c DNA group，the stimulation index of spleno-lymphocytes was（2.00±0.36），and the cell number of secreted IFN-γwas（41.48±5.30）SFC/106，which were both statistically higher than those in saline group（t=3.096，P＜0.05）.However，the percentages of CD4+and CD8+T cells［（18.15±2.30）%and（7.68±1.34）%］，and the activity of CTL［（29.52±1.96）%］were not significantly different with those in saline group（t=0.571，P＞0.05）.Conclusion The eukaryotic expression plasmid of Rv1733c was constructed successfully.The pcDNA-Rv1733c plasmid DNA could induce specific humoral and cellular immunity in mice.It may be used as the new TB vaccine against latent Mtb infection.

Mycobacterium tuberculosis； Antigens，bacterial； Vaccines，DNA； Antibody formation；Immunity，cellular

2013-07-08）

（本文編輯：薛愛華）

“十二五”國家科技重大專項（2012ZX10003008-007）；國家自然科學基金（30801055）

710048西安，陜西省結核病防治研究所（段安虎、王瑞）；第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院兒科（張薇）；第四軍醫(yī)大學微生物學與病原生物學教研室（柏銀蘭、康健、徐志凱、王麗梅）

王麗梅，Email：limwang@tom.com