基因芯片結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測在地市級實驗室的應用性評估

趙冰 時金艷 逄宇 夏輝 李強 歐喜超 宋媛媛 王玉峰 池俊英 趙雁林

·論 著 ·

基因芯片結(jié)核分枝桿菌耐多藥檢測在地市級實驗室的應用性評估

趙冰 時金艷 逄宇 夏輝 李強 歐喜超 宋媛媛 王玉峰 池俊英 趙雁林

目的 評估基因芯片耐多藥檢測利福平、異煙肼和耐多藥肺結(jié)核（MDR-TB）的效能，探討在地（市）級實驗室應用基因芯片的可行性。方法 對2011年1月1日至2012年3月31日在江蘇省連云港市涂片陽性的745例患者痰標本進行基因芯片檢查，去除傳統(tǒng)培養(yǎng)和非結(jié)核分枝桿菌等原因的111例，以傳統(tǒng)藥敏為金標準，在634例患者中分析對利福平、異煙肼和MDR診斷的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。結(jié)果 評估結(jié)果表明基因芯片對于利福平檢測的敏感度和特異度為84.4%（65/77）和97.7%（544/557）；對于異煙肼的敏感度和特異度分別為80.9%（76/94）和97.4%（526/540）；對于MDR的敏感度和特異度分別為70.0%（42/60）和98.3% （564/574）?；蛐酒蛡鹘y(tǒng)藥敏檢測一例涂陽患者的成本分別為165.65元和374.07元。結(jié)論 基因芯片檢測方法是一種在中國基層實驗室值得推廣的更高效、快捷、安全，以及更符合成本-效益的耐藥結(jié)核病診斷方法。

分枝桿菌，結(jié)核； 抗藥性，多種，細菌； 寡核苷酸序列分析； 實驗室，醫(yī)院； 評價研究

結(jié)核病仍然是全世界公共衛(wèi)生面臨的重大威脅［1］。耐多藥（同時對利福平和異煙肼耐藥）結(jié)核病和艾滋病被認為是結(jié)核病控制的最大難題。特別是在發(fā)展中國家，耐多藥結(jié)核病的疫情非常嚴重，全世界每年新發(fā)的44萬例耐多藥結(jié)核病患者中，有約1/2的患者來自于印度和中國［2］。由于結(jié)核分枝桿菌的低生長速率，傳統(tǒng)的細菌學藥敏試驗約需2～3個月才能獲得診斷結(jié)果，即便選用快速液體培養(yǎng)技術(shù)，也需要大約1～2個月時間獲得藥敏試驗結(jié)果［3］。這就導致了診斷的延遲，同樣不利于對患者開展有效的治療，并加速了耐藥結(jié)核病的傳播。因此，如何快速完成對結(jié)核病患者，特別是耐藥結(jié)核病患者的診斷是一個亟需解決的問題［4］。

基因芯片耐多藥檢測技術(shù)通過檢測標本中結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因的突變情況，從而判定對利福平和異煙肼的耐藥性［5］。早先文獻對其評價的結(jié)果表明，上述技術(shù)具有較理想的效能，其中對于臨床標本利福平和異煙肼檢測的敏感度分別為94.6%和78.1%［5］。目前尚缺乏基因芯片技術(shù)在地市級實驗室評估的數(shù)據(jù)，因此有必要在地（市）級結(jié)核病防治（簡稱“結(jié)防”）機構(gòu)實驗室開展評估，不僅彌補之前評估樣本的不足，同時為我國推廣該種技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究目的為：在條件有限的地（市）級實驗室評估基因芯片檢測利福平和異煙肼耐藥性的效能，從而為其進一步推廣提供數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、研究設計

從2011年1月1日至2012年3月1日，選取江蘇省連云港市作為項目實施地區(qū)，連續(xù)納入了項目地區(qū)所轄區(qū)縣發(fā)現(xiàn)的所有涂陽肺結(jié)核患者，每例患者要求提供2～3份痰標本，每份標本不少于2 ml；各區(qū)縣結(jié)防機構(gòu)在收集痰標本3 d內(nèi)將標本送往地（市）級實驗室。項目地（市）級實驗室選取同一份痰標本同時進行傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏試驗和基因芯片檢測。

二、患者納入

本評估項目總共納入了745例涂陽肺結(jié)核患者。在所有進行培養(yǎng)的標本中，有61份培養(yǎng)陰性（8.2%，61/745）和5份培養(yǎng)污染（0.7%，5/745），在進行傳統(tǒng)藥敏和菌種鑒定過程中，有17份（2.3%，17/745）菌種鑒定結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌，此外還有12份（1.6%，12/745）標本傳統(tǒng)藥敏結(jié)果失敗，因此最后獲得可用于分析藥敏結(jié)果者650例。在進行芯片檢測的標本中，分別有未檢測到結(jié)核分枝桿菌45例，非結(jié)核分枝桿菌15例及無法判讀結(jié)果16例，分別占總檢測標本的6.0%、2.0%和2.1%，總計獲得可用于分析基因芯片結(jié)果者669例。綜合傳統(tǒng)藥敏結(jié)果和基因芯片結(jié)果，總計有634例患者的檢測結(jié)果可用于分析基因芯片對于耐藥的檢測性能。

三、儀器和培養(yǎng)基

北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的基因芯片檢測系統(tǒng)、結(jié)核分枝桿菌耐多藥基因芯片檢測試劑盒；珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的羅氏培養(yǎng)基及藥敏培養(yǎng)基。

四、實驗室方法

地市級實驗室使用 N-乙酰半胱氨酸和氫氧化鈉溶液（NALC-NaOH）消化一份陽性級別較高的標本。消化液接種于改良羅氏培養(yǎng)基中，待4～8周后刮取菌落并按照文獻［6］的要求進行傳統(tǒng)藥敏試驗和菌種鑒定。

吸取1.2 ml消化液于1.5 ml離心管中，在離心半徑16 cm，12 000 r/min離心15 min后，使用PBS緩沖液洗滌；并再在離心半徑16 cm，12 000 r/min離心5 min后按照公司提供的說明書進行基因芯片操作［5］。

連云港第四人民醫(yī)院實驗室人員經(jīng)過國家參比實驗室培訓和認可，并且在項目正式實施前進行了為期6個月的試運行，以保證項目實施人員操作的熟練度。

五、成本分析

在項目實施期間，根據(jù)文獻報道［7］，采取“要素法”進行成本分析：收集不同檢測整個過程所有直接和間接成本，各要素包括：（1）管理費：維持實驗室正常運轉(zhuǎn)的基本費用，如水、電、辦公費、清潔、廢棄物和垃圾處理、安保等。（2）建筑費：實驗室建筑、改造及維修費用。（3）設備費：儀器設備購買、維修、維護費用。（4）人員費：從事檢測相關人員工資、福利、津貼費用。（5）試劑費：檢測相關試劑費用。（6）耗材費：耗材及個人防護相關費用。

六、倫理學

本研究經(jīng)過中國疾病預防控制中心和美國帕斯適宜衛(wèi)生科技組織倫理委員會的批準，并且所有納入項目的患者須在納入項目前簽署知情同意書。

七、統(tǒng)計學處理

所有原始數(shù)據(jù)在經(jīng)過國家參比實驗室復核后，錄入到SPSS 15.0中作為數(shù)據(jù)庫，并用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行整理分析，其中統(tǒng)計學檢測選用趨勢卡方檢驗，僅當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、基因芯片檢測利福平耐藥性效能分析

基因芯片能夠同時完成對結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性的檢測。對于利福平耐藥性檢測而言，在檢測的634例患者中，有609例患者的傳統(tǒng)藥敏結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，一致率為96.1%；其中在利福平傳統(tǒng)藥敏耐藥的77例患者中，基因芯片檢測到65例，敏感度為84.4%；在利福平表型敏感的557例中，基因芯片檢測到544例，特異度為97.7%；此外，基因芯片檢測利福平耐藥性的陽性預測值和陰性預測值分別為83.3%（65/78）和97.8% （544/556）（表1）。

表1 基因芯片對結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性診斷效能的分析（例）

二、基因芯片檢測異煙肼耐藥性的效能分析

在同時具有傳統(tǒng)藥敏試驗和基因芯片檢測的634例患者中，有602例患者的傳統(tǒng)藥敏試驗和基因芯片檢測對異煙肼耐藥性的診斷結(jié)果相同，一致率為95.0%；其中，對于94例傳統(tǒng)藥敏試驗異煙肼耐藥的患者而言，基因芯片檢測正確診斷出76例，其相應的敏感度為80.9%；此外，在傳統(tǒng)藥敏試驗異煙肼敏感的540例患者中，基因芯片檢測成功檢出526例，其檢測特異度為97.4%。在檢測的634例患者中，基因芯片檢測異煙肼耐藥性的陽性預測值和陰性預測值分別為84.4%（76/90）和96.7% （526/544）（表2）。

表2 基因芯片對結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性診斷效能的分析（例）

三、基因芯片檢測耐多藥結(jié)核病分析

綜合基因芯片檢測和傳統(tǒng)藥敏試驗對患者利福平和異煙肼診斷的結(jié)果，筆者統(tǒng)計了基因芯片檢測和傳統(tǒng)藥敏試驗對耐多藥結(jié)核病診斷的效果，結(jié)果如表3所示。其中，有606例（95.6%）患者基因芯片檢測與傳統(tǒng)藥敏試驗診斷結(jié)果一致。在傳統(tǒng)藥敏試驗診斷的60例耐多藥結(jié)核病患者中，基因芯片檢測成功檢出了42例，敏感度為70.0%；在傳統(tǒng)藥敏試驗診斷的574例非耐多藥結(jié)核病患者中，基因芯片檢測成功檢出了564例，特異度為98.3%。本評估結(jié)果中，基因芯片檢測耐多藥結(jié)核病患者的陽性預測值和陰性預測值分別為80.8%（42/52）和96.9%（564/582）。

表3 基因芯片對耐多藥結(jié)核分枝桿菌診斷效能的分析（例）

四、標本結(jié)核分枝桿菌陽性級別對基因芯片結(jié)果影響

標本結(jié)核分枝桿菌陽性級別（簡稱“陽性級別”）表示標本中結(jié)核分枝桿菌濃度的水平，可能對基因芯片的結(jié)果產(chǎn)生影響。為此，筆者統(tǒng)計了不同陽性級別標本中檢測結(jié)果為無法判讀和無分枝桿菌的比率，結(jié)果表明，隨著標本陽性級別的提高，無結(jié)果比率不斷降低，其中實際條數(shù)和“++++”標本中無結(jié)果比率分別為20.5%和2.1%，標本的陽性級別與無結(jié)果比率呈現(xiàn)出較高的相關性（χ2=18.919，P＜0.01）（表4）。

五、基因芯片檢測和傳統(tǒng)藥敏試驗成本分析

使用基因芯片檢測完成1例涂陽患者的成本為165.65元，而使用傳統(tǒng)藥敏試驗完成1例的成本為374.07元，傳統(tǒng)藥敏試驗檢測成本為基因芯片的2.26倍。其中基因芯片檢測成本中試劑費最高，占總成本的56.5%，其次為耗材費和管理費，分別占總成本的17.8%和17.1%。在傳統(tǒng)藥敏檢測成本中，試劑費、管理費和耗材費在總成本中所占比重較高，分別占36.9%，24.1%和22.2%（表5）。

表4 標本陽性級別對基因芯片檢測結(jié)果的影響

表5 基因芯片檢測和傳統(tǒng)藥敏試驗成本比較 （元，人民幣）

討 論

一、基因芯片診斷耐藥結(jié)核病的效能評價

基因芯片耐多藥檢測試劑盒是一種可以應用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的方法，特別是它可以直接應用于痰及其他臨床標本的檢測［5］。但是，到目前為止，罕有關于其在地（市）級實驗室基于臨床痰標本的大規(guī)模評估，特別是在耐藥結(jié)核病高負擔地區(qū)進行的評估［9］。近期一項在地（市）級實驗室對基因芯片的評估結(jié)果表明，其檢測利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為90.5%～91.2%和91.5%～98.4%；檢測異煙肼耐藥性的敏感度和特異度分別為69.0%～92.6%和87.0%～93.7%［7］。本研究結(jié)果與其結(jié)果比較接近，暗示在中國基層實驗室中，這種檢測方法在檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性時具有較好的敏感度和特異度。

二、基因芯片與同類檢測方法的比較

基因芯片和線性探針技術(shù)同屬于利用反向雜交檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥相關基因的檢測技術(shù)，因此，從理論上講兩者具有較類似的性能。先前研究中對線性探針技術(shù)進行了大量的評估，一篇 Meta分析結(jié)果表明［10］，線性探針檢測利福平的總敏感度和特異度分別為98.4%和98.9%，異煙肼為88.7%和99.2%，均高于本研究中的結(jié)果。而另一篇在國內(nèi)進行的對線性探針的評估結(jié)果與本研究結(jié)果相似［11］。導致這種差異的主要原因可能包括以下幾方面：首先，用于Meta分析的評估結(jié)果均源自于較高級別參比實驗室，而本研究中的實驗室均為基層地（市）級實驗室，因此，實驗室條件的限制以及實驗室人員進行實驗經(jīng)驗的不足可能影響評估結(jié)果；其次，本研究中同樣發(fā)現(xiàn)大量檢測樣品中基因型和表型結(jié)果不一致的情況，這可能與本評估中選用固體藥敏試驗，而非之前文獻主要采用的更敏感的液體藥敏試驗有一定關系。

三、基因芯片診斷耐藥結(jié)核病的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)藥敏方法相比，基因芯片具有諸多優(yōu)點。首先，基因芯片檢測更快捷，能夠在6 h內(nèi)完成整個檢測過程，因此可以為臨床制定有效的化療方案節(jié)省時間；其次，本方法是基于結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測，而非針對大量結(jié)核分枝桿菌的操作，因此，基因芯片比傳統(tǒng)藥敏試驗更安全；再次，基因芯片的通量較高，可以節(jié)省實驗室工作人員的時間。

四、標本陽性級別對基因芯片結(jié)果的影響分析

痰標本的陽性級別是表明痰標本中分枝桿菌含量的一個有效指標，由于基因芯片檢測方法基于對標本中結(jié)核分枝桿菌相關耐藥基因的擴增，因此不同陽性級別的標本可能對其結(jié)果產(chǎn)生影響，本研究發(fā)現(xiàn)隨著陽性級別不斷提高，無結(jié)果比例顯著降低，特別是在“實際條數(shù)”樣本中，無結(jié)果比率高達20.5%，這也就暗示大家基因芯片檢測對于實際條數(shù)級別標本的檢測結(jié)果可能在實際臨床使用過程中需要慎重考慮。同時筆者也在部分高陽性級別的標本中發(fā)現(xiàn)無檢測結(jié)果的情況，其中陽性級別為“++++”的標本中檢測無結(jié)果比率為2.1%，這主要可能是由于部分標本為血痰或干酪樣痰，其中蛋白含量較高，可抑制基因芯片的擴增反應，從而影響了結(jié)果的可讀性。然而，標本的陽性級別對診斷結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值方面影響不大，表明基因芯片檢測所獲得結(jié)果具有較高的準確性。

本研究評估結(jié)果表明，在基層實驗室中基因芯片檢測對于利福平和異煙肼耐藥性診斷方面具有較高的敏感度和特異度，并且成本更低，是一種值得在中國基層實驗室推廣的更高效、更快捷、更安全，以及更符合成本-效益的耐藥結(jié)核病的診斷方法。

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Evaluation of genechip in detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in the prefectural-level laborato-ry

ZHAO Bing*，SHI Jin-yan*，PANG Yu，XIA Hui，LI Qiang，OU Xi-chao，SONG Yuan-yuan，WANG Yufeng，CHI Jun-ying，ZHAO Yan-lin.*National Center for Tuberculosis Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

ZHAO Yan-lin，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the performance of genechip in detecting rifampicin resistant，isoniazid resistant and multidrug-resistant tuberculosis（MDR-TB），and to analyze the feasibility of genechip application in the prefectural-level TB laboratory.Methods The sputum samples collected from 745 smear positive TB patients detected in Lianyungang city from January 1st 2011 to March 31st 2012 were applied by both genechip and conventional drug susceptibility testing（DST）.Out of 745 TB patients，111 were excluded due to negative culture result and non-tuberculous Mycobacteria.The conventional DST results were served as the gold standard，the sensitivity，specificity，positive predictive value（PPV）and negative predictive value（NPV）were analyzed among 634 TB patients.Results The results showed that the sensitivity and specificity of genechip were 84.4%（65/77）and 97.7%（544/557）for rifampicin resistance，80.9%（76/94）and 97.4%（526/540）for isoniazid resistance and 70.0%（42/60）and 98.3%（564/574）for MDR respectively.The costs of genechip and conventional DST for detecting one smear positive TB patient were 165.65 yuan and 374.07 yuan，respectively.Conclusion Genechip is a more effectient，rapid，safer and more cost-effective diagnosis tool for drug-resistant tuberculosis in Chinese primary laboratories.

Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance，multiple； Oligonucleotide array sequence analysis； Laboratories，hospital； Evaluation studies

2013-07-08）

（本文編輯：薛愛華）

中國衛(wèi)生部與比爾及梅琳達·蓋茨基金會結(jié)核病防治項目（2009-04-01）

102206北京，中國疾病預防控制中心結(jié)核病預防控制中心（趙冰、逄宇、夏輝、李強、歐喜超、宋媛媛、王玉峰、池俊英、趙雁林）；連云港市第四人民醫(yī)院（時金艷）

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

注：趙冰和時金艷為并列第一作者