腎虛質(zhì)大鼠免疫相關(guān)因子含量變化與腎藏象理論的相關(guān)性研究＊

孫理軍 黨照麗 王 震 陜西中醫(yī)學院（咸陽712046）

本研究以中醫(yī)學理論為指導，采用貓嚇鼠的經(jīng)典造模方法［1］，造成具有中醫(yī)體質(zhì)理論特色的腎虛質(zhì)動物模型，并在大量文獻研究和臨床研究的基礎(chǔ)上，將腎藏象理論和現(xiàn)代免疫學知識結(jié)合，提出了腎虛體質(zhì)防御、修復適應能力降低與免疫功能失調(diào)密切相關(guān)的假設(shè)，從差異性角度研究腎藏象理論，根據(jù)腎虛體質(zhì)的生理病理特點，結(jié)合前期研究成果，以及細胞因子在免疫調(diào)節(jié)中的作用特性，進一步篩選出腎虛質(zhì)的特異血清免疫分子標志物，為腎藏象理論的現(xiàn)代研究提供范式，豐富和發(fā)展腎藏象理論。

1 實驗材料 1.1 實驗動物 3月齡SPF級SD 雄性大鼠30只，體重350g±20g，3月齡SPF級SD 雌性大鼠30只，體重250g±20g，購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證是SCXK（陜）2007－001，自由飲食飲水，室溫飼養(yǎng)。3月齡貓2只，兇狠善叫，喂食鮮活大鼠，室溫飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物及試劑 桂附地黃丸（原名金匱腎氣丸，蘭州佛慈制藥有限公司提供，批號10c7，每丸含生藥量0.375g），水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號：20090205），氯化鈉注射液（西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號091116122），無水乙醇（天津市紅巖化學試劑廠，批號20091016），IFN－γ、TNFα、IL－6ELISA 試劑盒（均由上海西唐生物科技有限公司提供，批號分別為：1007231，1007181，1007271），IL－10ELISA 試劑盒（由武漢博士德生物工程有限公司提供，批號為：138658）

1.3 主要實驗儀器及耗材 全自動酶標儀（美國Bio－Tek ELX808IU），電子精密天平（美國賽多利斯），醫(yī)用低溫冰箱（MDF－330，日本產(chǎn)），全自動高壓滅菌器（日本三洋mLS－3780），低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司KDC－40），電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學儀器有限公司DKZ系列）。

2 實驗方法 2.1 模型建立 參照我們以往建立腎虛質(zhì)大鼠模型的方法［2］，經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周無異常后，將30只雌性大鼠隨機分為2組：腎虛質(zhì)雌鼠組20只，正常質(zhì)雌鼠組10只，將雄性大鼠與雌性大鼠按1：1比例合籠配對5d后，檢測雌鼠陰栓判斷其是否懷孕，然后將腎虛質(zhì)組孕鼠放于特制大鼠籠內(nèi)，于每天定時進行恐嚇，直到其生產(chǎn)為止。正常組孕鼠，不予恐嚇，讓其自然待產(chǎn)。待兩組孕鼠分娩后，將生產(chǎn)的子鼠在不予恐嚇的情況下飼養(yǎng)滿60日齡后進行分組，隨機選取正常組孕鼠所產(chǎn)雄性子鼠8只作為空白組，選取腎虛質(zhì)組孕鼠所產(chǎn)雄性子鼠16只，隨機分為模型組及藥物組，每組8只。將模型組和藥物組的16 只子代鼠于每日定時進行恐嚇，持續(xù)1 個月?？瞻捉M不予恐嚇，其余時間各組均置于同一實驗室，保證非處理因素一致。

2.2 給藥方法 大鼠給藥量按文獻折算［3］，大鼠的用藥量約為人的6.25倍。桂附地黃丸每8丸含生藥量為3g，成人每日服生藥量為9g，則大鼠每日服生藥量為0.9375g／kg，用蒸餾水配成0.09375g／mL 混懸液，備用。對子代鼠恐嚇的同時開始灌胃，藥物組給予桂附地黃丸混懸液，空白組和模型組皆給予等量生理鹽水，10mL／kg，每日1次，共30d。

2.3 標本采集與處理 灌胃60d后分別處死，處死前禁食12h，翌日采用心臟取血方式，取血2mL，然后將其以3000轉(zhuǎn)／分離心15min，分離血清，置離心管內(nèi)，保存于－20℃冰箱待測。

2.4 指標檢測 IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α的檢測：使用美國Bio－Tek公司產(chǎn)品ELX808IU 型全自動酶標儀進行檢測，試劑盒是采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），具體操作步驟按照R＆D 公司的試劑盒說明書，進行檢測及計算。

3 結(jié) 果各組大鼠血清IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α的比較，見表1

表1 各組大鼠血清IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α 的比較（±s）

表1 各組大鼠血清IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α 的比較（±s）

注：與空白組比較△P＜0.05。

組別n IL－6（pg／mL）IL－10（pg／mL）IFN－γ（pg／mL）TNF－α（pg／mL）空白組8 53.29±37.11 135.91±94.74 49.27±18.55 177.92±67.27模型組8 89.95±37.11 62.59±50.57 27.91±9.51△337.70±80.58△藥物組8 76.72±25.22 107.52±93.60 34.49±10.16 277.48±73.48

如表1所示，與空白組相比，模型組IL－10、IFN－γ的含量均降低，IL－6、TNF－α含量升高，其中IFN－γ的降低和TNF－α的升高有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比，藥物組IL－10、IFN－γ的含量均升高，IL－6，TNF－α含量降低，均無統(tǒng)計學意義。

4 討 論 腎為先天之本，正氣之根，腎中精氣的盛衰是決定機體正氣強弱的重要因素。腎中精氣充足，則正氣旺盛，機體能夠抵抗外邪的侵襲，不易發(fā)病；反之，腎中精氣不足，則機體正氣化生不足，致使防御能力下降，外邪易乘虛侵襲而發(fā)病。現(xiàn)代研究表明，腎與免疫功能密切相關(guān)［4］，細胞因子的研究進展是免疫學研究中最為突出的成果之一。細胞因子在免疫－神經(jīng)－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起著重要的介質(zhì)作用，它的含量改變必然會破壞這一網(wǎng)絡(luò)的平衡狀態(tài)，進而破壞機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及內(nèi)外環(huán)境的統(tǒng)一，導致疾病的發(fā)生［5］。前期實驗研究表明腎虛質(zhì)與細胞因子參與免疫應答有一定的關(guān)系，為了全面探討腎虛質(zhì)大鼠免疫穩(wěn)態(tài)失衡的分子機理，可深入研究在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用的細胞因子，進一步篩選出腎虛質(zhì)的特異性免疫分子標志物。

本研究選擇細胞因子中具有代表性的IL－6、IL－10、IFN－γ、TNF－α作為觀察指標從分子水平研究其含量變化與腎藏象理論的相關(guān)性。其中IFN－γ和TNF－α是由Th1淋巴細胞分泌，介導細胞免疫應答；IFN－γ、TNF－α由Th2淋巴細胞分泌，輔助體液免疫應答，在過敏性疾病和感染性疾病中發(fā)揮作用。IFN－γ是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，能通過增強Th1細胞的活性而增強細胞免疫；通過抑制Th2的細胞增殖而抑制體液免疫。通過其細胞表面受體，誘導產(chǎn)生多種蛋白和酶，通過不同途徑、不同機制發(fā)揮抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。IL－10是免疫過程中重要的負調(diào)節(jié)因子，具有很強的抗炎和免疫抑制活性，它能抑制IL－6、TNF－α等促炎因子的產(chǎn)生和釋放［6］。TNF－α是炎癥反應過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，由活化的巨噬細胞和單核細胞分泌，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，可調(diào)節(jié)機體的免疫功能，參與炎癥多方面病理變化。IL－6也是炎癥反應中一種重要的細胞因子，可促進B 細胞增殖分化，并誘導其分泌抗體，促進T 細胞產(chǎn)生IL－2，并作為致熱原刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞引起機體發(fā)熱，參與調(diào)節(jié)免疫應答及機體的炎癥反應。

本實驗結(jié)果可見模型組大鼠IL－6、IL－10、的含量與空白組大鼠比均降低，IL－6、TNF－α含量與空白組大鼠比則升高。IFN－γ則可增強細胞免疫功能，而模型組大鼠可見其均降低，反映大鼠在受驚嚇之后機體免疫功能的降低；IL－6、TNF－α為促炎因子，其血清含量的升高可提示大鼠在長期受驚嚇的情況下會導致機體應激反應而產(chǎn)生促炎因子的升高，IL－10是公認的抑炎因子，模型大鼠IL－6、TNFα產(chǎn)生增多，IL－10生成減少，出現(xiàn)致炎因子與抑炎因子之間失衡，而致機體免疫系統(tǒng)紊亂。使用藥物對模型組大鼠進行干預后，可見IL－10、IFN－γ的含量升高，IL－6，TNF－α含量降低，可證機體的免疫功能的降低及紊亂得到了一定的糾正。研究結(jié)果表明：腎虛質(zhì)大鼠與細胞因子參與的免疫應答有一定的關(guān)系。

［1］ 王米渠，馬向東，段光周，等.“腎為先天之本”行為遺傳中關(guān)于“恐傷腎”的表征［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，1997，3（4）：23－25.

［2］ 孫理軍，李翠娟，王 震，等，腎虛質(zhì)實驗動物模型的構(gòu)建方法與評價［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）：247－249.

［3］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學實驗動物學［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：332－335.

［4］ 孫理軍，郝 蕊，薛 昶，等.腎虛質(zhì)大鼠CD4＋、CD8＋T 淋巴細胞亞群表達水平的研究［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（12）：1671－1672.

［5］ 朱長庚，李正莉.細胞因子與免疫－神經(jīng)－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［J］.解剖學報，1996，27（4）：339－344.

［6］ Skapenko A，Gerald U，Niedobitek，J R，et al.Generation andregulation of human Th1－biased immune responsesin vivo：acritical role for IL－4and IL－10［J］.J Immunol，2004，172（10）：6427－6434.