正交試驗(yàn)法優(yōu)選芪珠升白口服液最佳提取工藝＊

范少敏 郭 琳 張 旋 劉 超 王 珊 楊新杰 宋小妹 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽(yáng)712046）

芪珠升白口服液是多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)方，由珠子參、黃芪兩味中藥組成，具有提高機(jī)體免疫力、升高白細(xì)胞數(shù)的作用，用于放化療所致的白細(xì)胞減少癥的治療。現(xiàn)代研究表明，芪珠升白口服液富含多糖和皂苷，而且是其主要有效成分。因此，該實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分別以葡萄糖、竹節(jié)參皂苷IVa為對(duì)照品，以制劑中總多糖和總皂苷的含量及得率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［1，2］，對(duì)該制劑的提取純化條件進(jìn)行優(yōu)化，為該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑及藥材

1.1 儀器 RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），UV1102紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司），GB－204電子天平（瑞士梅特勒拖利多），SHD－3循環(huán)水多用真空泵鄭州杜甫儀器廠(chǎng)。

1.2 試劑 蒽酮、硫酸、香草醛、冰醋酸、無(wú)水乙醇、高氯酸、正丁醇。

1.3 藥材及對(duì)照品 珠子參藥材、黃芪藥材，購(gòu)自陜西省西安市萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng)。竹節(jié)參皂苷IVa對(duì)照品（自制，經(jīng)1HNMR、13CNMR、HMBC、HMQC及HR－MS確定結(jié)構(gòu)，面積歸一法計(jì)算含量均大于98%）；葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833－200503）。

2 方法及結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定方法建立

2.1.1對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取竹節(jié)參皂苷IVa對(duì)照品10mg，用甲醇溶解并定容至10mL，搖勻，即得濃度為1mg／mL的竹節(jié)參皂苷IVa對(duì)照品溶液。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液0.1mL于10mL具塞試管中，精密加入新配制的50g／L 的香草醛－冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，搖勻，置60 ℃水浴加熱15 min，冰水冷卻2min，精密加入冰醋酸5mL，搖勻，隨行試劑做空白，用紫外分光光度計(jì)在700nm～400nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全程掃描，最大吸收波長(zhǎng)在560nm 左右，故選擇560nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精密吸取竹節(jié)參皂苷IVa對(duì)照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，分別置于具塞試管中，揮盡溶劑。參照上述2.1.2項(xiàng)下方法，于560nm測(cè)定吸光度（Abs），以竹節(jié)參皂苷IVa含量為橫坐標(biāo)（X），吸光度Abs）為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。竹節(jié)參皂苷IVa對(duì)照品在100μg～600μg 范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝0.0563X＋0.0001，r＝0.9991。

2.2 總多糖含量測(cè)定方法建立

2.2.1葡萄糖對(duì)照品溶液制備：將葡萄糖對(duì)照品于60℃烘1h，再逐漸升溫至105℃干燥至恒重。精密稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品33mg，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含無(wú)水葡萄糖0.33mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：準(zhǔn)確移取對(duì)照品溶液0.1mL 于10mL具塞試管中，用蒸餾水定容，取2mL 于10mL的具塞試管中，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10min，取出，冰水浴冷卻10min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，紫外分光光度計(jì)在800nm～400nm 范圍全程掃描，結(jié)果顯示在620nm 左右有最大吸收，故確定620nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制［3，4］：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL分別置于10mL量瓶中，用蒸餾水定容，分別取2mL 于10mL 的具塞試管中，參照2.2.2項(xiàng)下方法，于620nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（Abs）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。葡萄糖在33μg～198μg范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Y＝0.0265X－0.0011，r＝0.9995。

2.3 提取工藝條件優(yōu)化研究

2.3.1正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)：多糖和皂苷為該復(fù)方制劑的主要有效成分。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1，2］，影響皂苷、多糖提取的主要因素有提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑體積，因此，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總多糖和總皂苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)方案對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表正交試驗(yàn)方案結(jié)果見(jiàn)表2 。

2.3.2供試品溶液制備：取處方量藥材粉末12g，共9份。按上述正交表方案組合進(jìn)行提取，濃縮，使各組藥液至50mL，即為各樣品溶液。

2.3.2.1多糖供試品溶液的制備：精密量取上述各樣品溶液30mL，加無(wú)水乙醇80mL，搖勻，離心，分離沉淀，沉淀用熱水溶解，冷卻，定容至100mL，搖勻，即得。

2.3.2.2 皂苷供試液的制備：精密上述各樣品溶液量取制劑20mL，以水飽和的正丁醇50mL 萃取兩次（25，25mL），萃取液合并，蒸干，精密加甲醇10mL溶解殘?jiān)?，搖勻，即得。

2.3.3 樣品含量測(cè)定［3］

2.3.3.1 多糖含量測(cè)定：精密吸取多糖供試品1mL 于10mL具塞試管中，加水2mL，搖勻，緩滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置60℃水浴中保溫10min，取出，立即置冰水浴中冷卻10min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在620nm 處測(cè)定吸光度。從多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多糖量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3.2 總皂苷含量測(cè)定：取樣品溶液0.2mL 至10mL 的量瓶中，用甲醇定容至刻度，取0.5mL 至具塞試管中，在水浴中揮盡溶劑，立即取出，放冷，參照上述2.1.2 項(xiàng)下方法，在560nm 處測(cè)定吸光度。據(jù)皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算皂苷量，見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

表3 多糖含量方差分析

表4 總皂苷含量方差分析

2.3.4 提取工藝的確定

2.3.4.1綜合表2、表3的分析結(jié)果，影響多糖指標(biāo)的因素大小順序?yàn)镃＞A＞D＞B，且C 因素有顯著性差異，A 因素K值大小順序?yàn)镵2＞K3＞K1，B 因素K 值大小順序?yàn)镵2＞K3＞K1，C因素K 值大小順序?yàn)镵3＞K2＞K1，綜合考慮，為達(dá)到指標(biāo)合理且除去雜質(zhì)，從多糖指標(biāo)得到的最優(yōu)工藝組合為A2B2C3。

2.3.4.2 根據(jù)表2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及表4的皂苷指標(biāo)方差分析數(shù)據(jù)，影響皂苷指標(biāo)的因素大小順序?yàn)锽＞A＞C＞D，但均無(wú)顯著性差異，A 因素K 值大小順序?yàn)镵3＞K2＞K1，B 因素大小順序?yàn)镵2＞K3＞K1，C 因素大小順序?yàn)镵2＞K3＞K1，從皂苷指標(biāo)得到的最佳工藝組合為A3B2C2。

1.3.4.3 綜合對(duì)多糖和皂苷指標(biāo)值及方差的分析，以及考慮到實(shí)際生產(chǎn)，得該口服液的最佳生產(chǎn)提取工藝為A2B2C3，即加8倍量水回流提取3次，每次1.5h。

2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按處方量分別取黃芪，珠子參各三份，按照優(yōu)選的最佳工藝即8倍量水，回流提取3次，每次1.5h進(jìn)行提取，使各組藥液濃縮到50mL，按以上方法分別測(cè)定三組樣品的總多糖和總皂苷含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，此方法穩(wěn)定可靠，可以作為芪珠升白口服液的提取工藝。

3 討 論 中藥的提取效果直接關(guān)系到制劑的質(zhì)量和療效，選擇合理的提取工藝是工業(yè)化大生產(chǎn)的前提和保障，合理的提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)是提取的有效成分質(zhì)量的代表，也是提取物臨床作用和療效的體現(xiàn)。目前，用提取物中成分含量評(píng)價(jià)提取效果應(yīng)用較多，此法量化程度高、易于操作，且具有耗資少的優(yōu)點(diǎn)。本文分別以葡萄糖、竹節(jié)參皂苷IVa為對(duì)照品，以制劑總皂苷和總多糖的含量及得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將二者綜合考慮作為工藝優(yōu)化的指標(biāo)。

［1］ 王淑萍，李曉靜，張桂珍.黃芪多糖提取分離純化工藝的優(yōu)化研究［J］.分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（1）：60－64.

［2］ 高培紅，曹軍毅，宋小妹.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選珠子參總皂苷的提取工藝［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，29（2）：66－68.

［3］ 王小平，王 進(jìn)，陳建章.建昌幫與樟樹(shù)幫、中國(guó)藥典法炮制的熟地黃中多糖含量比較［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（8）：1066－1067.

［4］ 王春燕，潘衛(wèi)三，楊建春，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方參芪軟膠囊的提取工藝［J］.中國(guó)藥師，2009，12（9）：1320－1321.