扶正抗癌方對H22移植瘤小鼠凋亡和端粒酶表達影響的實驗研究＊

方 瑜 楊柳青 王松林 陳光偉 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽 712046）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是臨床上最常見的且惡性程度最高的腫瘤之一，全球發(fā)病率、死亡率逐年增長，其中有近一半的新發(fā)患者和死亡患者都在我國[1]，在惡性腫瘤中死亡率僅次于肺癌列第二位[2]。是嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的疾病。本實驗欲通過建立H22腹水型瘤株移植瘤小鼠模型，觀察TGF-α和端粒酶的表達，來研究扶正抗癌方抗肝癌細(xì)胞生長的可能機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 瘤株 H22腹水型肝癌瘤株，（合格證號：SCXK（軍2012-008），第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）。

1.2 實驗動物 雌性健康KM小鼠85只，1～1.5月齡，體重18～22g，（動物合格證號：SCXK（陜2011-003））。

1.3 實驗用藥 扶正抗癌方（FZKAF）由陜中附院制劑研究中心提供，按成人體重60kg計算，20g小鼠每公斤體重生藥量折算為126g÷60kg×9.01×0.02kg＝0.378g，配置成1.89g／mL混懸液備用。對照藥替加氟（生產(chǎn)批號：20120305，50mg／片，）研磨，按成人用量加蒸餾水配制成15mg／mL的混懸液備用。

1.4 主要試劑 一抗：兔抗小鼠TGF-α單克隆抗體（bs-0066R，0.1mL），TRT／TERT 端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶抗體（bs-0233R，0.2mL）；二抗：羊抗兔多克隆抗體；DAB顯色劑（C-0003）；以上試劑均購于北京博奧森生物科技有限公司；SP免疫組化試劑盒（SP-9002，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。0.1mmol／L PBS緩沖液、4%多聚甲醛（陜西中醫(yī)學(xué)院中心實驗室）。

2 方 法

2.1 操作方法 抽取接種7d的小鼠腹水，染色后計算活腫瘤細(xì)胞數(shù)并用生理鹽水稀釋成1×107／mL的瘤細(xì)胞懸液。將瘤細(xì)胞懸液按0.25mL／只在小鼠右腋皮下接種造模。取15只健康小鼠作為A：空白對照組；再將造模成功的60只，分別分為B：荷瘤對照組；C：替加氟組；D：扶正抗癌方組；E組：扶正抗癌方組＋替加氟組。A、B組：用0.9% 生理鹽水灌胃；C組用15mg／mL替加氟稀釋液灌胃；D組用1.89g／mL中藥煎劑灌胃；以上用藥量均為0.2mL／只／d，連續(xù)14d用藥。E組用濃度為3.78g／mL中藥煎劑0.1mL／只及濃度為30mg／mL替加氟溶液0.1mL／只在第1d、第7d共同灌胃，其他時間用D組用藥方法，用藥14d。小鼠于第15d脫臼處死。

2.2 計算胸腺、脾臟指數(shù)測瘤重 摘除小鼠胸腺、脾臟，稱重；剝離瘤體稱重，固定于10%的甲醛中。臟器指數(shù)和抑瘤率計算公式如下：臟器指數(shù)＝臟器的重量／小鼠的體重，抑瘤率＝（荷瘤組平均瘤重－實驗組平均瘤重）／荷瘤組平均瘤重×100%。

2.3 免疫組化SP法測定TGF-α和端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達 腫瘤組織按常規(guī)病理取材，免疫組化SP法常規(guī)進行染色。TGF-α陽性反應(yīng)產(chǎn)物位于細(xì)胞漿或（和）細(xì)胞核，為棕色顆粒樣；端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶TERT陽性反應(yīng)產(chǎn)物位于細(xì)胞漿里，呈棕褐色或者棕黃色顆粒。實驗結(jié)果經(jīng)圖像分析軟件處理，每例隨機觀察5個視野（以每個視野下不少于100個細(xì)胞為準(zhǔn)），用400倍光學(xué)顯微鏡觀察，計算陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，分別采用方差分析和T檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著性。

3 結(jié) 果

3.1 各用藥組對肝癌細(xì)胞的抑制作用 見表1。

表1 各用藥組對肝癌細(xì)胞的抑制作用

3.2 各組小鼠免疫功能的表達 見表2。

表2 各組小鼠免疫功能的表達

3.3 各組小鼠癌組織中TGF－α和端粒酶的表達情況見表3。

表3 各用藥組荷瘤小鼠移植瘤TGF－α和端粒酶的表達

4 討 論 TGF-α（轉(zhuǎn)化生長因子α）是一小分子多肽，可誘導(dǎo)上皮發(fā)育，參與多種細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與EGF的氨基酸順序相似，與其受體（EGFR）結(jié)合級聯(lián)激活 MAPK信號系統(tǒng)（Raf-MEK-ERK），使糖酵解加速，蛋白質(zhì)合成增快，EGFR的表達增多，從而導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)[3]，TGF-α低表達可以加速肝癌細(xì)胞的凋亡，其高表達則會抑制肝癌細(xì)胞凋亡，二者呈負(fù)相關(guān)性。因此，隨著肝癌病程進一步加劇，血清中的 TGF-α水平則增高[4，5]。本實驗顯示，C、D、E 組 TGF-α蛋白的表達均降低（P＜0.05），其中E組最為明顯（P＜0.01），說明各用藥組可以通過抑制TGF－α的表達來抑制肝癌細(xì)胞增殖。端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合體，在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。在正常體細(xì)胞中幾乎不表達，而在腫瘤細(xì)胞中表達量較大，可以認(rèn)為端粒酶是腫瘤的特異性標(biāo)志物，能作為癌癥的早期診斷及腫瘤治療的靶點，隨著原發(fā)性肝癌的發(fā)展，端粒酶的表達增多[8]。本實驗顯示，與各用藥組比較，B組小鼠端粒酶活性增高（P＜0.05），說明各用藥物均可以抑制肝癌細(xì)胞中端粒酶的表達，其中以E組最為明顯（P＜0.01）。通過表1和表2可以看出在抑瘤率方面C組和D組都有抗腫瘤生長的作用（P＜0.01），但對小鼠免疫功能的影響上D組對小鼠免疫功能的保護作用明顯優(yōu)于C組（P＜0.01）。單純使用替加氟在消滅腫瘤細(xì)胞的同時也破壞了小鼠機體的免疫功能，但聯(lián)合使用扶正抗癌方后，小鼠的免疫功能得到保護，說明聯(lián)合用藥具有減毒增效的作用。肝癌的發(fā)生，是人體氣血虛弱，正氣不足，導(dǎo)致陰陽氣血失和，臟腑功能失調(diào)的基礎(chǔ)上，外受邪毒侵襲，出現(xiàn)氣滯、血瘀、濕聚、痰結(jié)等一系列病理變化，內(nèi)外合邪，形成腫瘤。在形成之后，又進一步耗傷氣血，日久“因癌致虛”，使正氣更虛，而癌癥本身“邪氣”較盛，正虛不勝邪而致癌瘤在體內(nèi)惡化、擴散、轉(zhuǎn)移。扶正抗癌方是陜西省名中醫(yī)陳光偉主任醫(yī)師總結(jié)多年經(jīng)驗得出的方劑，以“扶正祛邪”為大綱，選取黃芪、靈芝、女貞子各15g、起到扶正作用；莪術(shù)、山豆根、藤梨根各15g等藥根據(jù)不同腫瘤隨證加減，祛除體內(nèi)癌邪；白術(shù)、丹參、法半夏各12g健脾和血，補益后天，共助各藥運化；以上藥物為基礎(chǔ)方，臨證加減，在臨床上取得了良好療效。本次實驗結(jié)果說明扶正抗癌方抗肝癌的機理可能與降低TGF-α和端粒酶的表達及提高小鼠免疫功能有關(guān)。

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