依托咪酯對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元GABA能傳遞的抑制作用

劉宇煒，黃 丹，陳曉青，許曉利，李長雷，艾永循

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

依托咪酯對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元GABA能傳遞的抑制作用

劉宇煒，黃 丹，陳曉青，許曉利，李長雷，艾永循

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

目的：研究依托咪酯對大鼠腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元γ-氨基丁酸能傳遞的影響。方法：大鼠腹外側(cè)視前區(qū)切片，全細(xì)胞膜片鉗記錄神經(jīng)元抑制性突觸后電流。結(jié)果：依托咪酯（0.1 μmol/L）可逆性地降低腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的誘發(fā)抑制性突觸后電流幅度，但未能顯著性改變其配對脈沖比率。依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下，自發(fā)抑制性突觸后電流的頻率與幅度均顯著性下降，其動力學(xué)參數(shù)未受影響。結(jié)論：依托咪酯可作用于突觸前及突觸后γ-氨基丁酸受體而抑制對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的γ-氨基丁酸能傳遞，這一作用可能使其處于興奮狀態(tài)，進而抑制結(jié)節(jié)乳頭體核的組胺能神經(jīng)元，減少組胺釋放而發(fā)揮麻醉鎮(zhèn)靜作用。

依托咪酯；腹外側(cè)視前區(qū)；抑制性突觸后電流

睡眠和覺醒是人類的基本行為，其他如社會行為、飲食行為、性行為等與之密切相關(guān)。睡眠-覺醒周期乃機體生命之高級生理活動，是一個涉及多系統(tǒng)、多中樞的生理過程，具有復(fù)雜的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制。下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolat?eral preoptic area，VLPO）的神經(jīng)元具有非常重要的促進睡眠作用［1］。腹外側(cè)視前區(qū)存在著兩類主要的神經(jīng)元，它們對去甲腎上腺素（noradrena?line，NA）的反應(yīng)截然相反。大多數(shù)（約68%）為去甲腎上腺素所抑制［NA（-）］，而少部分為去甲腎上腺素所興奮［NA（+）］［2］。NA（-）神經(jīng)元為含有γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的長投射到結(jié)節(jié)乳頭體核（tuberomamillary nucleus，TMN）的睡眠促進細(xì)胞，亦即文獻通常所指的腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元；NA（+）神經(jīng)元可釋放GABA而抑制NA（-）神經(jīng)元的活動，屬該區(qū)局部神經(jīng)元［2-3］。

依托咪酯（etomidate）是一種咪唑衍生類藥物，因其具有良好的血液動力學(xué)特性，被廣泛用于臨床快速誘導(dǎo)麻醉［4］。作為一種靜脈麻醉劑，依托咪酯的作用主要為增強GABA遞質(zhì)傳遞，延長其突觸抑制作用時間［5］，但其對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的具體作用機制尚未明了。

在本實驗中，筆者采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，證明腹外側(cè)視前區(qū)GABA能神經(jīng)元突觸前后均存在有功能性的GABAA受體，通過激活這些受體，依托咪酯可能通過抑制對這些神經(jīng)元的GABA能傳遞而使處于興奮狀態(tài)，進而抑制結(jié)節(jié)乳頭體核的組胺能神經(jīng)元而發(fā)揮麻醉鎮(zhèn)靜效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley大鼠，鼠齡20～30天，雌雄不限，由江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

依托咪酯（etomidate），谷氨酸受體亞型拮抗劑（AP5和DNQX），γ-氨基丁酸A型受體阻斷劑（gabazine）和去甲腎上腺素（noradrenaline）購自Sigma公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

孵育液（mmol/L）：glycerol 250，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，調(diào)pH值至7.3。

人工腦脊液（ACSF）（mmol/L）：NaCl 125，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，調(diào)pH值至7.3。

電極內(nèi)液（mmol/L）：CsF 135，KCl 5，MgCl22，Hepes 10，Mg ATP 2，GTP 0.2，調(diào)pH值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腹外側(cè)視前區(qū)腦片的制備 參照筆者以前的實驗方法［3］，并在此基礎(chǔ)上稍加改進：無菌條件下迅速將大鼠斷頭取腦，置于混合氣（95%O2/5%CO2）飽和的冰冷（0～4℃）孵育液中約5 min。在0℃通混合氣條件下，采用振動切片機（VF-300，美國Precisionary公司）將腹外側(cè)視前區(qū)腦組織切成250 μm厚的冠狀切片，置于混合氣飽和的孵育液中，室溫（22～24℃）下孵育至少1 h以上。

1.2.2 電生理記錄 玻璃微電極由P-97電極拉制儀（美國Sutter公司）分兩步拉制，充灌電極內(nèi)液后阻抗為4～6 MΩ。將腦片置于操作臺正中約0.4 mL凹槽內(nèi)，用一鉑金環(huán)壓住。BX51正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下選大鼠腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元。全細(xì)胞膜片鉗記錄所用儀器為Axo?patch 700B膜片鉗放大器（美國Molecular公司），在電極與細(xì)胞膜之間形成高阻（1～5 GΩ）封接后，進一步將膜吸穿，調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補償。數(shù)據(jù)以5 kHz過濾，使用Axonscope 1.1.1 acquisition軟件通過Axon DigiData-1440A記錄于電腦上。整個記錄過程中采用混合氣飽和的人工腦脊液持續(xù)灌流，灌流速度約2 mL/min。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Sigmaplot 11.0（Jandel Scientific）和SPSS 16.0進行處理、統(tǒng)計分析和制圖。實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，統(tǒng)計結(jié)果采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依托咪酯對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元誘發(fā)抑制性突觸后電流的抑制作用

筆者以前的研究表明，NA（-）神經(jīng)元形狀多為三角或多角形，短暫（30 s）給予去甲腎上腺素（100 μmol/L）后可引起超極化，并且神經(jīng)元還具有低閾值放電（low-threshold spike，LTS）的特性［3］，這和有關(guān)報道是一致的［2］。本次實驗選用的神經(jīng)元均為NA（-）神經(jīng)元。在AP5（50 μmol/L）和二硝基喹酮（6，7-Dinitro-1，4-dihydro-quinoxa?line-2，3-dione，DNQX，20 μmol/L）存在條件下，膜電位（VH）鉗制于0 mV時，通過刺激電極可激活誘發(fā)抑制性突觸后電流（eIPSCs），這些電流可被γ-氨基丁酸A型（GABAA）受體阻斷劑gabazine（10 μmol/L，未作圖示）完全阻斷，證明其為GABAA受體所介導(dǎo)。如圖1A所示，通過配對電刺激（刺激間距50 ms）誘發(fā)出成對的抑制性突觸后電流。依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下第一個誘發(fā)抑制性突觸后電流幅度減小了（51.7±4.8）%（從（53±10）pA到（22±6）pA，n=8；P＜0.01，圖1A和圖1B（a）），但未引起配對脈沖比率（paired-pulse ratio，PPR=IPSC2/IPSC1）發(fā)生顯著性改變（從（1.1±0.1）到（1.0±0.1），n=8；P＞0.05，圖1A和圖1B（b）），發(fā)這一結(jié)果證明依托咪酯可減少突觸后GABAA釋放。

圖1 依托咪酯抑制腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元誘發(fā)抑制性突觸后電流

2.2 依托咪酯對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元自發(fā)抑制性突觸后電流的抑制作用

進一步研究依托咪酯對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）的影響。在AP5（50 μmol/L）和DNQX（20 μmol/L）存在條件下，膜電位（VH）鉗制于0 mV時，自發(fā)抑制性突觸后電流可被gabazine（10 μmol/L，未作圖示）所完全阻斷，證明其為GABAA受體所介導(dǎo)。如圖2A所示，依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下使自發(fā)抑制性突觸后電流頻率下降了（38.4±3.3）%（從（1.3± 0.5）Hz到（0.8±0.2）Hz，n=7；P＜0.01），這一作用為可逆性的，在正常人工腦脊液沖洗之后，電流頻率恢復(fù)到對照組的（99.4±2.8）%（n=7；P＞0.05）。第二次給予依托咪酯（0.1 μmol/L）后，自發(fā)抑制性突觸后電流頻率又下降了（39.9± 3.7）%，其下降幅度與第一次給藥間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=7；P＞0.05），并且其頻率在正常人工腦脊液沖洗后及時恢復(fù)。同時，在依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下，自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSCs）幅度也降低了（10.3±0.8）%（從（17.8± 1.9）pA到（16.2±1.8）pA，n=7；P＜0.05，圖2B），而其動力學(xué)參數(shù)并未改變（圖2B右）。

如圖2C所示，依托咪酯（0.1 μmol/L）的作用效果進一步為累積概率圖所顯示，其作用顯著延長了連續(xù)的自發(fā)抑制性突觸后電流之間的釋放間隔（K-S檢驗，P＜0.01），同時明顯減小電流幅度（K-S檢驗，P＜0.05）。

圖2 依托咪酯抑制腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元自發(fā)抑制性突觸后電流

3 討論

依托咪酯是臨床上最常用的靜脈麻醉藥，由于它具有起效快、蘇醒迅速、對循環(huán)、呼吸系統(tǒng)影響較輕等優(yōu)點，因此被廣泛用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持中。依托咪酯主要通過調(diào)節(jié)GABAA受體氯離子通道產(chǎn)生麻醉作用，它能夠增強GABAA受體的效能以及與配體結(jié)合的能力，間接抑制中樞興奮性遞質(zhì)的傳遞［5-6］。

下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)與睡眠調(diào)節(jié)密切相關(guān)。最近有報道指出腹外側(cè)視前核損毀前后給予依托咪酯，通過記錄腦電圖與心電圖，分析睡眠、覺醒時相變化及Fos基因在腹外側(cè)視前核的表達變化，認(rèn)為依托咪酯可經(jīng)腹外側(cè)視前核的γ-氨基丁酸能神經(jīng)元通路產(chǎn)生促眠作用［7］。

本研究的全細(xì)胞膜片鉗表明，作用于腹外側(cè)視前區(qū)腦片時，依托咪酯（0.1 μmol/L）可逆性地降低腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元誘發(fā)抑制性突觸后電流幅度，但未引起配對脈沖比率顯著性改變，這一結(jié)果表明依托咪酯可減少突觸后GABA釋放。接下來，在依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下，sIPSCs的頻率與幅度均顯著性下降，其動力學(xué)參數(shù)未受影響，表明依托咪酯可作用突觸前及突觸后GABA受體而抑制對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的GABA能傳遞。

腹外側(cè)視前區(qū)的GABA能神經(jīng)元與結(jié)節(jié)乳頭體核的組胺能神經(jīng)元之間的交互抑制在睡眠-覺醒轉(zhuǎn)換過程中起著最核心的調(diào)節(jié)作用。在睡眠過程中，腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元快速放電，通過釋放GABA（以及galanin）抑制結(jié)節(jié)乳頭體核，引起自身去抑制，放電進一步增加；反過來，在覺醒狀態(tài)下，結(jié)節(jié)乳頭體核組胺能神經(jīng)元放電增加，以釋放組胺（histamine）為主、同時還釋放少量GA?BA到腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元，可產(chǎn)生抑制作用，進而去抑制結(jié)節(jié)乳頭體核神經(jīng)元，使其放電活動更為增強［8］。

綜上所述，依托咪酯可作用于GABA受體而抑制對腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的GABA能傳遞，這一作用可能使其處于興奮狀態(tài)，進而抑制結(jié)節(jié)乳頭體核的組胺能神經(jīng)元，減少組胺釋放而發(fā)揮麻醉作用。這很可能是依托咪酯產(chǎn)生麻醉鎮(zhèn)靜效果的重要作用機制之一。

［1］ Nelson L E，Guo T Z，Lu J，et al.The sedative compo?nent of anesthesia is mediated by GABA（A）receptors in an endogenous sleep pathway［J］.Nature neurosci?ence，2002，5（10）：979-984.

［2］ Gallopin T，F(xiàn)ort P，Eggermann E，et al.Identification of sleep-promoting neurons in vitro［J］.Nature，2000，404（6781）：992-995.

［3］ Liu Y W，Li J，Ye J H.Histamine regulates activities of neurons in the ventrolateral preoptic nucleus［J］.J Physiol，2010，588（Pt 21）：4103-4116.

［4］ Chan C M，Mitchell A L，Shorr A F.Etomidate is asso?ciated with mortality and adrenal insufficiency in sep?sis：A meta-analysis［J］.Crit Care Med，2012，［Epub ahead］.

［5］ Garcia P S，Kolesky S E，Jenkins A.General Anesthet? ic Actions on GABAA Receptors［J］.Curr Neurophar?macol，2010，8（1）：2-9.

［6］ Vanlersberghe C，Camu F.Etomidate and other non-barbiturates［J］.Handb Exp Pharmacol，2008，（182）：267-282.

［7］ 張敏，范坤，邵玉峰，等.依托咪酯經(jīng)腹外側(cè)視前核γ-氨基丁酸能神經(jīng)元產(chǎn)生促眠作用［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，37（1）：1-5，10.

［8］ Saper C B，Scammell T E，Lu J.Hypothalamic regula?tion of sleep and circadian rhythms［J］.Nature，2005，437（7063）：1257-1263.

Etomidate Inhibits GABAergic Transmission in Neurons in Ventrolateral Preoptic Area

LIU Yu-wei，HUANG Dan，CHEN Xiao-qing，XV Xiao-li，LI Chang-lei，AI Yong-xun
（School of Medicine，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Objective：To study the effect of etomidate on GABAergic transmission in neurons of rat ventrolateral preoptic（VLPO）area.Methods：Rat ventrolateral preoptic area slices were pre?pared.Inhibitory postsynaptic current（IPSC）were investigated using whole-cell patch-clamp re?cording in VLPO neurons.Results：Etomidate（0.1 μmol/L）reversibly decreased the amplitude of evoked IPSC in VLPO neurons，without changing its paired-pulse ratio（PPR）.Etomidate（0.1 μmol/L）decreased the frequency and amplitude of spontaneous IPSC，did not induce appreciable change in the kinetics of the spontaneous IPSC.Conclusion：Etomidate may act presynaptically and postsynaptically to suppress GABAergic transmission to VLPO neurons，this effect may excite these neurons，lead to the inhibition of histaminergic neurons in tuberomamillary nucleus，which will de?crease releasing of histamine and result in anesthesia and sedation.

etomidate；ventrolateral preoptic（VLPO）area；inhibitory postsynaptic current（IPSC）

R338.2-33

：A

：1673-0143（2013）01-0076-04

（責(zé)任編輯：范建鳳）

2012－10－08

湖北省自然科學(xué)基金重點項目（2008CDA053）；武漢市科技計劃項目（201250499145-27）

劉宇煒（1973—），男，副教授，博士，研究方向：神經(jīng)生物學(xué)。