正交法優(yōu)法牛蒡莖總黃酮提取工藝的研究

田代學(xué) 楊 婷 吳 娟 楊 蘭 武 蕓

【摘 要】利用正交試驗方法對牛蒡莖總黃酮的提取工藝進行研究。在單因素試驗基礎(chǔ)上選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間、提取溫度4個因素3個水平進行正交試驗，以總黃酮的得率為考察指標(biāo)，探討這4個因素對黃酮提取率的影響。結(jié)果表明：較優(yōu)的工藝提取參數(shù)為：乙醇濃度60%，液料比1：15，提取時間120min，提取溫度60℃。

【關(guān)鍵詞】牛蒡；總黃酮；單因素試驗；正交試驗

牛蒡（Arctium lappal）又名白肌人參，為中國古老的藥食兩用食物蔬菜[1]。牛蒡可每日食用而無任何副作用，對體內(nèi)各系統(tǒng)的平衡具有復(fù)原功能，且含有黃酮類化合物（Flaonoids），黃酮類化合物有抗菌、抗衰老、降低血糖等作用。目前對牛蒡的研究大多集中于牛蒡子和牛蒡葉的化學(xué)成分和藥理活性上，關(guān)于牛蒡莖化學(xué)成分的研究較少報道[2]。就目前牛蒡的開發(fā)現(xiàn)狀來看，其開發(fā)也主要集中在食用價值方面，而對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究不夠，資源浪費嚴(yán)重。牛蒡是我國傳統(tǒng)中藥，其主要的藥用部分是牛蒡子（牛蒡的瘦果），具有祛風(fēng)熱、消腫痛的作用[3]。本研究采用索氏提取法，對牛蒡莖總黃酮提取工藝條件進行優(yōu)化，確定其最佳提取工藝，旨在為牛蒡的綜合開發(fā)和解決資源浪費問題提供技術(shù)支撐，以實現(xiàn)資源的最大化利用。

1.試驗材料、試劑和儀器

1.1材料與試劑

洗凈的牛蒡莖，烘干粉碎備用。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，無水乙醇，氫氧化鈉，硝酸鋁，亞硝酸鈉（以上均為分析純），實驗所用水均為蒸餾水，實驗中所需溶液均現(xiàn)配。

儀器：電熱恒溫水浴鍋，電子天平，紫外分光光度計，索氏提取器，量筒（50mL、10mL），移液管，10mL小試管，圓底燒瓶，比色管，容量瓶。

1.2 試驗方法

1.2.1原料的預(yù)處理

牛蒡莖→除雜→水洗→烘干→粉碎

1.2.2總黃酮的含量測定

利用黃酮類化合物中的3-羥基、4-羥基、5-羥基、4-羰基或鄰二位酚羥基，與鋁離子進行絡(luò)合反應(yīng).在堿性條件下生成紅色絡(luò)合物的原理測定其含量。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL于6支10.00mL的小試管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇稀釋到4.00mL處，加人5%的亞硝酸鈉溶液0.30mL，混勻，放置10min，加入10%硝酸鋁溶液0.30mL ， 混勻，放置10min，再加入4%的氫氧化鈉溶液4.00mL， 混勻，放置10min，加入60%的乙醇溶液至刻度，搖勻，10min后于波長500nm處測定吸光度，（以第一瓶為空白溶液）以吸光度Y為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁濃度（C）與吸光度（A）關(guān)系式：Y=7.0553X+0.0017，R2=0.9984

1.2.4 單因素試驗

分別以乙醇濃度（50%、55%、60% 65%、70%）、提取時間（1 h、1.5 h、2h、2.5h、3 h）、提取溫度（40℃、50℃ 、60℃ 、70℃、80℃）以及料液比（1：5、1：10、1：15、1：20、1：25）為單因素進行試驗，考察各單因素對浸提液中總黃酮得率的影響。

1.2.5正交試驗設(shè)計

本實驗選取提取溫度、料液比、浸提時間和乙醇濃度這四個對牛蒡黃酮提取率影響顯著的因素，進行4因素3水平正交試驗。正交試驗設(shè)計因素的水平如表1所示。

2.結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對牛蒡莖總黃酮提取率的影響

由結(jié)果（見表2）可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮提取率增大，當(dāng)濃度達到60%時提取率最大；但乙醇濃度繼續(xù)增加，提取率則明顯下降，當(dāng)濃度達到70%時提取率最小，故宜選用60%乙醇為提取溶劑。

2.1.2提取時間對黃酮提取率的影響

用60%的乙醇，在60℃，液料比1：20的條件下提取。由表3可知，隨著提取時間的延長黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)提取時間為3h時，黃酮的提取率最高，但繼續(xù)增加提取時間時，提取率反而有所下降，長時間受熱會破壞有效成分，雜質(zhì)含量可能也相對增加。因此，實驗確定最佳提取時間為3 h。

2.1.3液料比的改變對牛蒡黃酮提取率的影響

用60%乙醇，分別以液料比1：5、1：10、1：15、1：20、1：25進行提取，溫度控制在60℃，提取3h，可以看出，隨提取液料比的增加，黃酮提取率逐漸增大，在1：20時提取率最大。如表4所示。過多的溶劑使得雜質(zhì)含量變大，并且給后序的濃縮帶來困難。因此，本實驗確定最佳液料比為1：20。

2.1.4提取溫度的改變對黃酮提取率的影響

用60%乙醇，1：20液料比，分別在40℃、50℃ 、60℃ 、70℃、80℃的條件下提取3h，測定總黃酮的提取率。結(jié)果（見表5）表明，隨著溫度的升高，總黃酮提取率存在一個極大值，當(dāng)溫度為60℃時，提取率最高。溫度過高，活性成分易被破壞。因此，較佳的提取溫度定在60℃。

2.2牛蒡總黃酮提取工藝條件優(yōu)化

2.2.1正交試驗法優(yōu)化牛蒡黃酮提取工藝條件結(jié)果

選取料液比、提取時間、提取溫度、乙醇濃度為考察因素，以提取鐵皮石斛總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，進行四因素三水平正交實驗，確定最佳工藝條件參數(shù)。

通過上述試驗可以得到：R2>R1>R3>R4，即提取溫度對牛蒡總黃酮的提取影響最大，乙醇濃度次之，時間對牛蒡總黃酮提取影響第三，液料比對牛蒡總黃酮的提取率影響相對較小。表中4因素的水平組合情況，在A3B3C1D2組合條件下提取率最高，最佳組合即料液比1：15，提取時間2h，提取溫度60℃，乙醇濃度60%。

3.結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗得出了牛蒡總黃酮最優(yōu)的提取條件：溫度60℃，料液比1：15，時間2h，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。牛蒡是一種中度耐鹽的植物，隨著對其活性作用的研究的不斷深入，生產(chǎn)出高附加值的保健品，具有客觀的經(jīng)濟效益和社會效益[4]。

參考文獻：

[1] 魏東，王連翠.牛蒡根的研究進展[J]，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（15）：3716-3717.

[2] 馬魯豫，馬振環(huán).牛蒡根化學(xué)成分的提取、分離和鑒定[J]，山東醫(yī)藥，2011，51（19）：44.

[3] 孟楣，廖自榮，周建理.牛蒡的生藥學(xué)研究[J].基層中藥雜志，2000，14（4）：27-28.

[4] 謝輝，李霞等.牛蒡有效成分的提取及活性研究進展[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用2010，4（23）：238-239

基金項目：

湖北省自科基金項目（2009CD155），湖北民族學(xué)院科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新課題（K201126）。

作者簡介：

武蕓（1971.4-）：通訊作者，女，理學(xué)碩士，副教授，主要從事植物生物技術(shù)及生物資源保護與利用的教學(xué)與研究。