HPLC法測(cè)定清腦止痛膠囊中阿魏酸含量的研究

孫亞玲 賈敬全 曾 艷 孫申國(guó) 吳 丹

（吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司，吉林 敖東 137000）

HPLC法測(cè)定清腦止痛膠囊中阿魏酸含量的研究

孫亞玲 賈敬全 曾 艷 孫申國(guó) 吳 丹

（吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司，吉林 敖東 137000）

目的 建立清腦止痛膠囊中阿魏酸的含量測(cè)定方法。方法 以Agilent Explise C18柱為色譜柱，乙腈、1%醋酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，HPLC法測(cè)定。結(jié)果 本法測(cè)定清腦止痛膠囊中阿魏酸線性范圍為（0.2106～8.424）μg/mL，精密度、18h內(nèi)穩(wěn)定性、方法重現(xiàn)性良好，十批樣品的測(cè)試平均含量2.83μg/粒。結(jié)論 本方法適用于清腦止痛膠囊中阿魏酸含量控制。

高效液相；含量測(cè)定；阿魏酸；清腦止痛膠囊

清腦止痛膠囊是2008年批準(zhǔn)上市的中藥6類新藥，以川芎、藁本為主藥，故筆者選擇其有效成分阿魏酸作為含量控制指標(biāo)，并進(jìn)行了含量測(cè)定和相關(guān)方法學(xué)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；MS105型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó) METTLE公司）；HU10260B型超聲儀（天津恒奧科技有限公司）。

1.2 藥品及試劑

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-200611，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）；Oasis HLB 200mg 6cc固相萃取柱（批號(hào)061A35324A，美國(guó)Waters公司）；清腦止痛膠囊（吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純，水為純水，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Explise C18柱（5.0μm，250×4.6mm），流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，1%醋酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～28 min，A∶B=13～87∶87～13；29～38 min，A∶B=87～100∶13～0；39～50 min，A∶B=100～13∶0～87。檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm，柱溫：30℃，流速：1.0mL/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含2μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱定2g，加入鹽酸-水（1∶100）溶液25mL，置水浴中加熱回流40分鐘，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，轉(zhuǎn)移至經(jīng)活化過(guò)的固相萃取柱上（Waters Oasis HLB 200mg 6cc），用水及20%甲醇的鹽酸-水（1∶100）溶液分別洗脫除雜，再用10mL80%甲醇的鹽酸-水（1∶100）溶液洗脫，收集洗脫液，60℃水浴蒸干，殘?jiān)?0%甲醇的鹽酸-水（1∶100）溶液溶解，轉(zhuǎn)移至2mL量瓶中，加80%甲醇的鹽酸-水（1∶100）溶液稀釋，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3 結(jié) 果

3.1 樣品處理方法

依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部中“川芎”、“藁本”、含量測(cè)定項(xiàng)下及參考文獻(xiàn)[1,2]中阿魏酸含量測(cè)定方法，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行考察。結(jié)果阿魏酸含量較低，一步提取的前處理方法雜質(zhì)較多，不能達(dá)到基線分離，調(diào)節(jié)酸堿萃取除雜的方法雖能除去部分雜質(zhì)，但反復(fù)的酸堿調(diào)節(jié)有可能破壞阿魏酸結(jié)構(gòu)，而且操作繁瑣，容易造成損失影響回收率，故依據(jù)參考文獻(xiàn)[3,4]，采用固相萃取的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行除雜和富集。

結(jié)果表明，固相萃取的前處理方法雜質(zhì)干擾少，達(dá)到基線分離，且方法簡(jiǎn)單易操作，故確定為本研究的前處理方法。

3.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

在所選HPLC條件下，分離效果好，保留時(shí)間22.529min，理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算為15934，與相鄰峰的分離度為2.06。

3.3 專屬性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL進(jìn)樣，結(jié)果表明兩者相同保留時(shí)間有對(duì)應(yīng)的色譜峰，峰形良好。結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

圖1 阿魏酸對(duì)照品色譜圖

圖2 清腦止痛膠囊（批號(hào)20110801）樣品色譜圖

3.4 線性關(guān)系考察

將對(duì)照品貯備液用甲醇稀釋為0.2106、0.421μg/mL、0.8424、2.106、4.212、8.424μg/mL，分別精密吸取10μL進(jìn)樣，以峰面積對(duì)質(zhì)量進(jìn)行回歸，回歸方程為：Y＝5482.3X-0.1797（r=0.9999），表明阿魏酸在0.2106～8.424μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)20110801）裝量差異下的內(nèi)容物適量，按前法處理。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18小時(shí)取供試品溶液10μL進(jìn)樣，峰面積40.0～42.3，均值40.8，RSD1.80%，表明供試品溶液在18h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.6 精密度試驗(yàn)

取本品（批號(hào)20110801）裝量差異下的內(nèi)容物適量，按前法處理。取供試品溶液10μL，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果峰面積40.0～41.1，均值40.38，RSD為1.04%，表明進(jìn)樣精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)20110801）裝量差異下的內(nèi)容物適量，按前法處理。將供試品溶液、對(duì)照品溶液10μL進(jìn)樣，計(jì)算含量。結(jié)果均值4.18μg/粒（n=6），RSD1.49%，表明重復(fù)性良好。

3.8 回收率試驗(yàn)

取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約1g，精密稱定，平行6份，同時(shí)分別精密加入濃度為10.53μg/mL的阿魏酸對(duì)照品溶液，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液10μL進(jìn)樣，計(jì)算含量。結(jié)果表明，平均回收率為96.14%，RSD為0.62%。

3.9 樣品測(cè)定

取本品十批，按照2的方法處理測(cè)定，阿魏酸平均含量為2.83μg/粒。見(jiàn)表1。

4 結(jié) 論

清腦止痛膠囊現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)僅對(duì)打粉藥味的成分進(jìn)行了含量控制，為此，選擇非打粉藥味開(kāi)展含量測(cè)定方法的研究。方中非打粉藥味涉及川芎、藁本、牛膝、熟地黃、蒺藜、枸杞子、香附、細(xì)辛等8味藥材，其川芎和藁本占處方總量的21.4%，為處方中主藥，考慮到《中國(guó)藥典》2010年版一部“川芎”、“藁本”含量測(cè)定項(xiàng)下均以阿魏酸為指標(biāo)成分，故試選擇阿魏酸作為清腦止痛膠囊含量控制指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行了含量測(cè)定和相關(guān)方法學(xué)研究。

表1 清腦止痛膠囊中阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，以Agilent Explise C18柱為色譜柱，以乙腈、1%醋酸水為流動(dòng)相建立梯度洗脫的含量測(cè)定方法，該法專屬性強(qiáng)、耐受性和重現(xiàn)性好，適用于清腦止痛膠囊中阿魏酸含量控制。

[1] 章澤恒,譚朝陽(yáng).HPLC法測(cè)定婦科十味膠囊中阿魏酸的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2006,13(2):40.

[2] 許江,張慶,俞小陶.HPLC法測(cè)定活血止痛膠囊中阿魏酸的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2000,16(4):309.

[3] 孔亮,于志遠(yuǎn),鄒漢法,等.高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析測(cè)定川芎中有效成分阿魏酸與藁本內(nèi)酯[J].分析化學(xué),2004,32(11):1501.

[4] 陳雯,陳富超,李鵬,等.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定補(bǔ)虛顆粒阿魏酸含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,29(2):247.

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1671-8194（2013）26-0069-02