調(diào)控釀酒酵母類異戊二烯合成途徑強(qiáng)化芳樟醇合成

孫明雪，劉繼棟，堵國成,2，周景文，陳堅(jiān),2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

2 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122

芳樟醇屬于非環(huán)單萜醇，是一種植物次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，在食品、香化、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域均具有重要應(yīng)用價(jià)值[2]。目前，芳樟醇的合成主要采用植物提取和化學(xué)合成兩種方法?；瘜W(xué)合成方法通常比較昂貴，并且由于萜類物質(zhì)具有特定的親和性和專一性，通常只能較為經(jīng)濟(jì)地合成部分結(jié)構(gòu)簡單的萜類[3]。從天然芳香植物中提取單萜因產(chǎn)量和提取效率較低、易受各種自然因素影響，導(dǎo)致大部分單萜類化合物的價(jià)格居高不下[4]。利用微生物細(xì)胞合成單萜，因其原料來源廣泛、產(chǎn)物單一且生產(chǎn)周期短，成為替代植物提取和化學(xué)合成的方法之一[5]。

目前以釀酒酵母作為合成萜類物質(zhì)的真核表達(dá)系統(tǒng)正日益得到研究者的重視[6-7]。釀酒酵母通過內(nèi)源類異戊二烯代謝途徑提供香葉基二磷酸(GPP)，可作為單萜生物合成的前體物質(zhì)(圖1)[8]。2007年，Oswald 等在釀酒酵母中引入仙女扇Clarkia breweri 來源的芳樟醇合成酶基因，但是由于異源芳樟醇合成酶表達(dá)量過低，導(dǎo)致檢測不到目的產(chǎn)物芳樟醇[9]。2008年，Herrero等在野生型釀酒酵母的類異戊二烯生物合成途徑上引入芳樟醇合成代謝支路，成功構(gòu)建重組菌株并且能夠有效分泌芳樟醇[10]。2010年，Rico等在釀酒酵母中成功表達(dá)了仙女扇來源的芳樟醇合成酶基因，并通過調(diào)節(jié)類異戊二烯生物合成途徑使芳樟醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高，達(dá)到30.19μg/L[11]。

圖1 釀酒酵母中類異戊二烯代謝途徑(包括芳樟醇合成支路)Fig.1 Isoprenoid pathway in Saccharomyces cerevisiae,including the branch point to (S)-linalool.Dotted arrows indicate that more than one reaction is required to convert the substrate to the product indicated.Dashed arrows indicate the engineered steps.

為了獲得高產(chǎn)芳樟醇的釀酒酵母工程菌株，本研究在已經(jīng)成功表達(dá)來源于軟棗獼猴桃Actinidia arguta 的芳樟醇合成酶基因的基礎(chǔ)上[12]，進(jìn)一步調(diào)控類異戊二烯生物合成途徑，增加芳樟醇合成前體的供給，實(shí)現(xiàn)了對(duì)tHMG1與IDI1基因的調(diào)控，使芳樟醇的產(chǎn)量提高了1.3倍，從(59.85±4.05)μg/L 增加至(127.71±7.68)μg/L。本研究在釀酒酵母工程菌中獲得較高的芳樟醇產(chǎn)量，為實(shí)現(xiàn)芳樟醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶及試劑

芳樟醇(97%)購自Sigma-Aldrich 公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、ExTaq DNA 聚合酶、pMD18-T Simple Vector、感受態(tài)制備試劑盒、膠回收、片段回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。各種化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株及質(zhì)粒如表1所示。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉10 g/L，需要時(shí)加入氨芐青霉素至終濃度為100μg/mL；YNB 液體培養(yǎng)基：硫酸銨5 g/L，YNB 1.7 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 調(diào)至5.6，115℃滅菌15 min，滅菌后加入過濾除菌的卡那霉素至終濃度為100μg/mL。根據(jù)需要選擇添加亮氨酸、組氨酸、色氨酸、尿嘧啶等，使其在培養(yǎng)基中終濃度為50μg/mL，氨基酸溶液在105℃滅菌10 min；YPD 液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，115℃滅菌15 min，在滅菌后加入過濾除菌的卡那霉素至終濃度為100μg/mL。固體培養(yǎng)基均在液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉。

表1 本研究中所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.4 搖瓶培養(yǎng)條件

種子液的制備：將重組菌從氨基酸缺陷型平板上刮取一單菌落至20 mL YNB 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h 后，即為種子液。重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)接種子液至50 mL 新鮮YPD液體培養(yǎng)基，使OD600達(dá)到0.05，在30℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h。

1.2 方法

1.2.1 DNA 片段的擴(kuò)增與重組

以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組為模板，用引物IDI1-R 和IDI1-F 擴(kuò)增IDI1基因序列(引物序列見表2)，獲得基因長度867 bp 的IDI1基因。PCR 程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與載體連接pMD18-T Simple，陽性克隆小量抽提質(zhì)粒酶切鑒定，并進(jìn)行DNA 測序。將序列正確并純化的PCR 產(chǎn)物經(jīng)過NotⅠ和SacⅡ雙酶切，連接至經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pYLIS 中，獲得AaLS1基因與IDI1基因共表達(dá)載體pYLIS-IDI1。

tHMG1基因是HMG-CoA 還原酶具有催化作用的蛋白C 末端編碼區(qū)域[15]。以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組為模板，用HMG1-R 和HMG1-F 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增tHMG1基因(引物序列見表2)，獲得基因長度1578 bp 的tHMG1基因。PCR 程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接 pMD18-TSimple，小量抽提質(zhì)粒酶切鑒定，進(jìn)行DNA 測序。將序列正確并純化的PCR 產(chǎn)物經(jīng)過SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接至經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的釀酒酵母整合表達(dá)載體pRS305-TEF1中，獲得tHMG1基因整合表達(dá)載體pRS305-tHMG1。

表2 PCR 擴(kuò)增所需引物Table 2 Primers used for PCR amplification

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建

釀酒酵母轉(zhuǎn)化均采用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化方法[16]。轉(zhuǎn)化后涂布于相對(duì)應(yīng)的氨基酸缺陷YNB平板，挑選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR 驗(yàn)證。

1.2.3 氣相色譜與質(zhì)譜(GC-MS)分析與檢測

在20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加入2 g NaCl，注入5 mL 預(yù)冷的發(fā)酵溶液樣品，加蓋密封墊和鋁帽，壓緊。頂空吸附溫度95℃保溫30 min。使用Shimadzu GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。色譜條件：Rax-Wax 色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25μm)；程序升溫條件：初始溫度60℃，保持30 s，以8℃/min升溫至100℃，立即以30℃/min升溫至200℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度為240℃，載氣(氦氣)流速為1 mL/min；不分流。質(zhì)譜條件：EI 電離源，電子能量70 eV；質(zhì)量掃描方式：選擇離子掃描：m/z 71，93和121；定量離子71。

采用外標(biāo)法測定芳樟醇樣品的濃度，計(jì)算結(jié)果取3個(gè)平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的平均值；配制4個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為10、100、1000、10000μg/L，分別測定在GC-MS 上的響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 麥角固醇測定方法

采用吸光度法測定釀酒酵母菌株麥角固醇含量，具體測定方法見參考文獻(xiàn)[17]。其中菌體干重(Dry cell weight)測定方法，首先收集發(fā)酵液，4000 r/min 離心10 min，蒸餾水洗滌菌體1～2次后取沉淀，60℃烘至恒重，稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 IDI1基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組DNA 為模板，采用PCR 法擴(kuò)增IDI1基因，擴(kuò)增出特異性譜帶，大小約為867 bp。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，將序列正確PCR 產(chǎn)物經(jīng)NotⅠ和SacⅡ酶切并純化后，與經(jīng)相同酶切的載體pYLIS 連接。在含有氨芐抗性的LB 平板上篩選陽性克隆，并通過菌落PCR 鑒定陽性克隆(圖略)。抽提重組克隆菌株質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和SacⅡ酶切得到相應(yīng)大小片段(圖2)，驗(yàn)證 IDI1基因與載體相連，載體pYLIS-IDI1構(gòu)建成功。

2.2 tHMG1基因克隆和整合表達(dá)載體構(gòu)建

以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組DNA 為模板，采用PCR 法擴(kuò)增tHMG1基因，擴(kuò)增出特異性條帶，大小約為1578 bp。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序，將序列正確PCR 產(chǎn)物經(jīng)SpeⅠ和BamHⅠ酶切并純化后，與經(jīng)相同酶切的載體pRS305-TEF1連接。在含有氨芐的LB 平板上篩選陽性克隆，并通過菌落PCR 鑒定陽性克隆(圖略)。抽提重組質(zhì)粒經(jīng)SpeⅠ和BamHⅠ酶切得到相應(yīng)大小片段(圖3)，驗(yàn)證tHMG1基因與載體相連，載體pRS305-tHMG1構(gòu)建成功。

圖2 pYLIS-IDI1質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of plasmid pYLIS-IDI1 by enzyme digestion.M:DNA marker DL10000;1:pYLIS-IDI1 digested with NotⅠand SacⅡ.

圖3 pRS305-tHMG1質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.3 Identification of plasmid pRS305-tHMG1 by enzyme digestion.M:DNA marker DL10000;1:pRS305-tHMG1 digested with BamHⅠand SpeⅠ.

2.3 釀酒酵母工程菌株構(gòu)建

將整合表達(dá)質(zhì)粒pRS305-tHMG1導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2-1C，成功構(gòu)建釀酒酵母tHMG1基因整合表達(dá)菌株LS01。將IDI1基因表達(dá)載體pYLIS-IDI1導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2-1C 和LS01中，分別構(gòu)建工程菌株LS02和LS03。

2.4 調(diào)控類異戊二烯合成途徑對(duì)麥角固醇含量的影響

麥角固醇是類異戊二烯合成途徑終產(chǎn)物甾醇的主要前體，同時(shí)也是釀酒酵母細(xì)胞膜的重要組成部分。因此，類異戊二烯合成途徑代謝流的變化可能會(huì)伴隨麥角固醇合成的增加或減弱，而麥角固醇含量微小變化能夠反應(yīng)代謝途徑上的重要改變[18]。通過測定釀酒酵母工程菌株麥角固醇含量(圖4)，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)兩基因后麥角固醇合成量從(14.26±1.11) mg/g DCW 增加至(17.68±1.44) mg/g DCW。結(jié)果表明，調(diào)控IDI1和tHMG1基因可以增加麥角固醇合成量。

圖4 調(diào)控類異戊二烯合成途徑對(duì)麥角固醇含量的影響Fig.4 Effect on the content of ergosterol by regulating the isoprenoid pathway in S.cerevisiae.A:the control strain expressing the gene of AaLS1;B:the strain LS02 expressing the genes of AaLS1 and IDI1;C:the strain LS03 expressing the genes of AaLS1,IDI1 and tHMG1.

2.5 類異戊二烯合成途徑的調(diào)控

為了進(jìn)一步提高芳樟醇產(chǎn)量，必須消除代謝途徑的限制因素，提高限制酶的表達(dá)水平。IDI1基因編碼類異戊二烯基焦磷酸異構(gòu)酶，該酶參與可逆的異構(gòu)化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)IPP 與DMAPP 的相互轉(zhuǎn)化，是控制所有萜類生物合成的第一步，調(diào)控該酶的表達(dá)水平對(duì)單萜化合物合成具有重要作用[19]。在釀酒酵母中，調(diào)節(jié)IDI1基因表達(dá)量，表達(dá)質(zhì)粒 pYLIS-IDI1，使芳樟醇含量提高了69.6%，達(dá)到(101.46±3.45)μg/L，單位細(xì)胞芳樟醇含量從8.61μg/g DCW 提高至15.24μg/g DCW。HMG-CoA 還原酶是類異戊二烯合成途徑上的關(guān)鍵限速酶，它催化HMG-CoA 合成甲羥戊酸的反應(yīng)為不可逆的，其活性的不足會(huì)導(dǎo)致該途徑代謝通量降低。因此，我們進(jìn)一步提高HMG-CoA 還原酶水平，構(gòu)建tHMG1基因整合表達(dá)菌株，并在該菌株中表達(dá)質(zhì)粒pYLIS-IDI1，使芳樟醇產(chǎn)量提高至(127.71±7.68)μg/L，單位細(xì)胞芳樟醇含量提高9.4%，增加至16.66μg/g DCW (圖5)。通過對(duì)工程菌株生長曲線進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)表達(dá)tHMG1基因使菌體生長有一定程度提高，可能由于代謝流增加對(duì)菌體生長有促進(jìn)作用，表達(dá)IDI1基因后菌體生長有減弱趨勢?？傮w來說，在釀酒酵母工程菌合成芳樟醇過程中，產(chǎn)物芳樟醇未對(duì)菌株生長造成致命影響(圖6)。

3 討論

在釀酒酵母工程菌株成功表達(dá)軟棗獼猴桃來源的芳樟醇合成酶基因的基礎(chǔ)上，本研究強(qiáng)化類異戊二烯合成途徑，調(diào)控IDI1與tHMG1基因表達(dá)水平，使芳樟醇產(chǎn)量達(dá)到(127.71±7.68)μg/L，是Rico 等[11]報(bào)道在釀酒酵母工程菌中獲得的芳樟醇最高產(chǎn)量的3倍。

圖5 調(diào)控類異戊二烯途徑芳樟醇產(chǎn)量和單位細(xì)胞芳樟醇含量Fig.5 Final concentrations of linalool and yields of linalool on biomass after regulating the isoprenoid pathway.A:the control strain LS04 expressing the gene of AaLS1;B:the strain LS02 expressing the genes of AaLS1 and IDI1;C:the strain LS03 expressing the genes of AaLS1,IDI1 and tHMG1.

圖6 釀酒酵母工程菌生長曲線的測定Fig.6 Growth curves of engineered strains.() the control strain transformed with the empty vector of pY26-TEF1-GPD in CEN.PK2-1C;() the strain LS02 expressing the genes of AaLS1 and IDI1;() the strain LS03 expressing the genes of AaLS1,IDI1 and tHMG1;() the strain LS04 expressing the gene of AaLS1.

釀酒酵母能夠通過內(nèi)源類異戊二烯合成途徑合成GPP，但是水平較低，限制了芳樟醇合成量，因此提高胞內(nèi)GPP 供給是增加芳樟醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。對(duì) IDI1基因的調(diào)控能夠調(diào)節(jié) IPP/DMAPP 比例，將代謝流平衡轉(zhuǎn)向?qū)PP 生產(chǎn)有利的方向，進(jìn)而增加單萜物質(zhì)的合成[20]。過量表達(dá)IDI1基因后使芳樟醇產(chǎn)量從(59.84±4.05)μg/L提高至(101.46±3.45)μg/L。在類異戊二烯合成途徑中，研究證實(shí)HMG-CoA 還原酶是關(guān)鍵限速酶，解除該酶的限制作用對(duì)促進(jìn)類異戊二烯化合物積累起重要作用[21]。Verwaal 等[22]在釀酒酵母中過量表達(dá)該酶活性區(qū)域tHMG1基因使胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高。Rico 等[11]通過提高tHMG1基因表達(dá)水平，使芳樟醇產(chǎn)量從(21.92±1.75)μg/L提高至(30.19±3.88)μg/L。我們在改造IDI1基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步表達(dá)tHMG1基因，使芳樟醇產(chǎn)量提高1.3倍，達(dá)到(127.71±7.68)μg/L。

本研究通過調(diào)控類異戊二烯合成途徑代謝流，提高GPP 合成前體供給，構(gòu)建芳樟醇高產(chǎn)的釀酒酵母工程菌。繼續(xù)對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，將獲得更高芳樟醇產(chǎn)量，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

[1]Chang MCY,Keasling JD.Production of isoprenoid pharmaceuticals by engineered microbes.Nat Chem Biol,2006,2(12):674?681.

[2]Mahmoud SS,Croteau RB.Strategies for transgenic manipulation of monoterpene biosynthesis in plants.Trends Plant Sci,2002,7(8):366?373.

[3]Dudareva N,Pichersky E.Metabolic engineering of plant volatiles.Curr Opin Biotechnol,2008,19(2):181?189.

[4]Siddiqui MS,Thodey K,Trenchard I,et al.Advancing secondary metabolite biosynthesis in yeast with synthetic biology tools.FEMS Yeast Res,2012,12(2):144?170.

[5]Nevoigt E.Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae.Microbiol Mol Biol R,2008,72(3):379?412.

[6]Huang BB,Guo J,Yi B,et al.Heterologous production of secondary metabolites as pharmaceuticals in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol Lett,2008,30(7):1121?1137.

[7]Kong JQ,Zhi XH,Wang W,et al.Synergistic effect of amorpha-4,11-diene synthase gene in engineered Saccharomyces cerevisiae.Chin J Biotech,2011,27(2):196?202(in Chinese).孔建強(qiáng),支曉慧,王偉,等.紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在酵母工程菌中具有協(xié)同.生物工程學(xué)報(bào),2011,27(2):196?202.

[8]Kirby J,Keasling JD.Biosynthesis of plant isoprenoids:perspectives for microbial engineering.Ann Rev Plant Biol,2009,60:335?355.

[9]Oswald M,Fischer M,Dirninger N,et al.Monoterpenoid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae.FEMS Yeast Res,2007,7(3):413?421.

[10]Herrero ó,Ramón D,Orejas M.Engineering the Saccharomyces cerevisiae isoprenoid pathway for de novo production of aromatic monoterpenes in wine.Metab Eng,2008,10(2):78?86.

[11]Rico J,Pardo E,Orejas M.Enhanced production of a plant monoterpene by overexpression of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase catalytic domain in Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microb,2010,76(19):6449?6454.

[12]Chen XY,Yauk Y,Nieuwenhuizen NJ,et al.Characterisation of an (S)-linalool synthase from kiwifruit (Actinidia arguta) that catalyses the first committed step in the production of floral lilac compounds.Funct Plant Biol,2010,37(3):232?243.

[13]Sikorski RS,Hieter P.A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.Genetics,1989,122(1):19?27.

[14]Li AM,Liu ZS,Li QX,et al.Construction and characterization of bidirectional expression vectors in Saccharomyces cerevisiae.FEMS Yeast Res,2008,8(1):6?9.

[15]Munoz-Bertomeu J,Sales E,Ros R,et al.Up-regulation of an N-terminal truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase enhances production of essential oils and sterols in transgenic Lavandula latifolia.Plant Biotechnol J,2007,5(6):746?758.

[16]Gietz RD,Schiestl RH,Willems AR,et al.Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.Yeast,1995,11(4):355?360.

[17]Asadollahi MA,Maury J,Moller K,et al.Production of plant sesquiterpenes in Saccharomyces cerevisiae:effect of ERG9 repression on sesquiterpene biosynthesis.Biotechnol Bioeng,2007,99(3):666?677.

[18]Fischer MJC,Meyer S,Claudel P,et al.Metabolic engineering of monoterpene synthesis in yeast.Biotechnol Bioeng,2011,108(8):1883?1892.

[19]Berthelot K,Estevez Y,Deffieux A,et al.Isopentenyl diphosphate isomerase:a checkpoint to isoprenoid biosynthesis.Biochimie,2012,94(8):1621?1634.

[20]Ignea C,Cvetkovic I,Loupassaki S,et al.Improving yeast strains using recyclable integration cassettes,for the production of plant terpenoids.Microb Cell Fact,2011,10(1):4.

[21]Ohto C,Muramatsu M,Obata S,et al.Overexpression of the gene encoding HMG-CoA reductase in Saccharomyces cerevisiae for production of prenyl alcohols.Appl Microbiol Biot,2009,82(5):837?845.

[22]Verwaal R,Wang J,Meijnen J,et al.High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.Appl Environ Microbiol,2007,73(13):4342?4350.