黃粉蟲抗菌肽在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化及活性分析

熱依汗古麗?阿里木，毛新芳，劉忠淵

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830046

1972年瑞典科學(xué)家Boman HG 等[1]研究果蠅免疫時(shí)首次發(fā)現(xiàn)抗菌肽以后，1981年Steiner H等[2]從天蠶蛹的免疫血淋巴中誘導(dǎo)分離得到最早的抗菌肽——天蠶素(Cecropin)。隨后人們從細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并分離了具有抗菌活性的多肽，是生物體免疫防御系統(tǒng)的重要成分[3]?？咕木哂袕V譜殺菌特性以外，具有特殊的抗菌作用機(jī)制，不易導(dǎo)致耐藥性，而且對(duì)有些真菌、病毒和多種癌細(xì)胞及腫瘤有良好的殺傷作用，因此抗菌肽作為一種新型抗菌制劑倍受關(guān)注，成為了生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4-5]。

但天然抗菌肽資源有限，提取工藝復(fù)雜，化學(xué)合成難以產(chǎn)業(yè)化，基因工程獲得的抗菌肽容易被蛋白酶水解，分離和純化成本高，因此需要尋找一種成本低、生產(chǎn)效率高、活性高的抗菌肽的方法。

抗菌肽基因工程表達(dá)系統(tǒng)主要為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩種，雖然真核表達(dá)系統(tǒng)具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾和分泌能力，較客觀地表達(dá)天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并維持其生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，但酵母生長(zhǎng)存在速度慢、表達(dá)效率低、提純工藝復(fù)雜和成本高的缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)周期短、表達(dá)量高、成本低等特點(diǎn)，是生產(chǎn)抗菌肽最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。但抗菌肽分子量小且對(duì)宿主菌有毒性，一般采用融合表達(dá)策略。融合蛋白可以減少對(duì)宿主菌產(chǎn)生的殺傷作用，且可以提高抗菌肽表達(dá)水平，同時(shí)表達(dá)出來的抗菌肽帶上融合蛋白中含有的特異性標(biāo)簽，便于融合蛋白的分離純化[6]。本研究將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-30a-tmAMP1m 誘導(dǎo)表達(dá)，探索在不同誘導(dǎo)條件黃粉蟲融合蛋白HIS-TmAMP1m 的高效表達(dá)，分析誘導(dǎo)條件的改變對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，并將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和生物活性檢測(cè)，為進(jìn)一步利用基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)高活性重組抗菌肽奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

重組質(zhì)粒pET-30a-tmAMP1m 為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、葡萄球菌Staphylococcus sp.、谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum、蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis、棒狀桿菌Corynebacterium sp.為本實(shí)驗(yàn)室保存，使用LB 培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)Marker 購自天根生化科技有限公司；感受態(tài)細(xì)胞BL21購自北京全式金公司；Fermentas 預(yù)染蛋白Marker 購自Thermo Scientific 公司；ECL Western blotting 檢測(cè)試劑盒購自GE Healthcare 公司；抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體、Anti-mouse IgG-HRP 二抗購自康為世紀(jì)公司；His 標(biāo)簽純化樹脂(Ni-NTA Resin)購自QIAGEN 公司；BSA、DTT、Glycine 等購自Sigma 公司；IPTG、卡那霉素購自TaKaRa 公司；透析袋、超濾膜、超濾管等購自美國(guó)Millipore公司；Bradford 法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 HIS-TmAMP1m 的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-30a-tmAMP1m 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種到含Kana的LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)。次日按1%比例接種到LB 培養(yǎng)基(含Kana)中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)菌液至 OD600為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h，4℃、10000 r/min 離心5 min，收集菌體。冰浴進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞(振幅設(shè)為300 W；超聲循環(huán)為：超聲5 s，間隔5 s，時(shí)間設(shè)為10 s)，4℃、12000 r/min 離心10 min，分別取上清和沉淀煮沸30 min，4℃、12000 r/min 離心30 min，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測(cè)(上層膠為5%，下層膠為10%)。

1.3 HIS-TmAMP1m 表達(dá)條件的優(yōu)化

黃粉蟲抗菌肽表達(dá)條件的優(yōu)化分別在不同的溫度、IPTG 濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)黃粉蟲抗菌肽進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取樣進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 電泳，然后用Bandscan 軟件分析目的蛋白的表達(dá)量。采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法[7]觀察不同培養(yǎng)條件下表達(dá)的黃粉蟲抗菌肽所形成的抑菌圈大小，計(jì)算不同培養(yǎng)條件下發(fā)酵液的抑菌圈直徑。其中表達(dá)量最高的、抑菌圈最大的那組所對(duì)應(yīng)的條件即為最適培養(yǎng)條件。

1.4 HIS-TmAMP1m 的親和純化及Western blotting 檢測(cè)

將融合蛋白按QIAGEN 公司的NTA-Ni 親和層析柱說明書進(jìn)行純化，純化的蛋白用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)透析，并超濾濃縮，取樣進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 分析。Tricine-SDS-PAGE 電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉過夜。次日，先用抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體孵育2 h，后用帶有辣根過氧化物酶的Anti-mouse IgG-HRP 二抗孵育1.5 h，然后用ECL 法進(jìn)行曝光和顯影。

1.5 HIS-TmAMP1m 的活性檢測(cè)

1.5.1 HIS-TmAMP1m 表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)影響

將含有pET-30a-tmAMP1m 質(zhì)粒的大腸桿菌BL21及BL21空白菌接種LB，37℃振蕩培養(yǎng)3 h，加IPTG 誘導(dǎo)，每隔0.5 h 取菌液測(cè)其OD600值并記錄數(shù)據(jù)，并設(shè)未誘導(dǎo)的含pET-30a-tmAMP1m質(zhì)粒BL21轉(zhuǎn)化菌為對(duì)照。

1.5.2 HIS-TmAMP1m 的最小抑菌濃度測(cè)定

測(cè)定融合蛋白HIS-TmAMP1m 對(duì)金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 、葡萄球菌Staphylococcus sp.、谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum 、蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis、棒狀桿菌Corynebacterium sp.等5種菌的抑菌活性并計(jì)算其最小抑菌濃度(MIC)[8-9]。將固體培養(yǎng)基融化并冷卻至不燙手時(shí)(約45℃左右)，將6 mL 培養(yǎng)基與10μL 菌液(OD600=0.5)混合，迅速倒入培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，最終培養(yǎng)基厚度為1 mm。在凝固的培養(yǎng)基上打孔，直徑為2 mm，分別往孔洞中加入2μL 梯度稀釋后的融合蛋白(分別稀釋0、2、4、8倍，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度)，置于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，測(cè)量其抑菌圈直徑。將蛋白濃度(nmol)轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)形式，抑菌圈直徑(cm)轉(zhuǎn)換為平方形式，作圖獲得直線圖，最后根據(jù)公式：CL=2.93/(a k10m/k)計(jì)算融合蛋白最小抑菌濃度(CL)(其中：a 表示培養(yǎng)基厚度(cm)；k 表示直線圖斜率；m 表示直線圖截距)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 HIS-TmAMP1理化性質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)

1.6.1 HIS-TmAMP1m 的熱穩(wěn)定性

將濃度為0.076 g/L 融合蛋白HIS-TmAMP1m 于100℃煮沸10 min、30 min、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、10 h 后，分別取樣，4℃、12000 r/min 離心20 min，收集上清，測(cè)定對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，以未經(jīng)熱處理的樣品為對(duì)照，同時(shí)設(shè)PBS 緩沖液為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 HIS-TmAMP1m 的反復(fù)凍溶穩(wěn)定性

將濃度為0.076 g/L 融合蛋白HIS-TmAMP1m 置于?20℃冰箱分別反復(fù)凍溶1、2、4、6、8和10次后，4℃、12000 r/min離心20 min，收集上清液，進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。以未經(jīng)過凍溶處理的樣品作為對(duì)照，同時(shí)設(shè)PBS緩沖液為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 HIS-TmAMP1m 的酸堿穩(wěn)定性

將濃度為0.076 g/L 融合蛋白HIS-TmAMP1m 與pH 值分別為4、5、6、7、8、9、10、11和12緩沖液(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)混合，靜置10 min 后，4℃、12000 r/min 離心20 min，收集上清，進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，以未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照，同時(shí)設(shè)pH 4～12緩沖液為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.4 HIS-TmAMP1m 對(duì)有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性

將濃度為0.076 g/L，1 mL 融合蛋白HIS-TmAMP1m 進(jìn)行冷凍干燥處理后，分別加入等體積的10%的甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿、正丁醇，混勻，室溫放置24 h 后檢測(cè)抑菌活性。以未加任何有機(jī)溶劑處理的樣品作對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.6.5 HIS-TmAMP1m 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性

在37℃水浴條件下，用反應(yīng)濃度均為l g/L的蛋白酶K、胰蛋白酶分別處理濃度為0.076 g/L融合蛋白30 min，測(cè)定各種酶處理液的抑菌活性。以不加酶處理的融合蛋白為對(duì)照，同時(shí)設(shè)PBS 緩沖液為陰性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 5 Demo 軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIS-TmAMP1m 氨基酸序列分析

將黃粉蟲cDNA 序列推斷出來其氨基酸序列為：FPLRRAATAEEIEQGEHIRVKRVTCDILS VEAKGVKLNDAACAAHCLFRGRSGGYCNGK RVCVCR，利用Expasy 中的InterPro Scan 對(duì)氨基酸序列與PROSITE.Pfam、PRINTS 和其他家族、結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比對(duì)，TmAMP1m 包含防御素(Defensin)、脊椎動(dòng)物/真菌中的Defensin、節(jié)肢動(dòng)物Defersin-2、Knottin、gammathionin 功能域，具有一定的保守性。說明黃粉蟲融合蛋白HIS-TmAMP1m 可能含有較多的二硫鍵，屬于防御素(Defensin)家族。

2.2 HIS-TmAMP1m 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響

融合蛋白HIS-TmAMP1m 分別在20℃、25℃、28℃、30℃和37℃下誘導(dǎo)表達(dá)。從圖1可以看出，不同的培養(yǎng)溫度對(duì)融合蛋白表達(dá)量和活性有較大的影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)融合蛋白表達(dá)量最高，利用Bandscan 軟件分析，HIS-TmAMP1m 融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量37.8%，但隨著溫度的降低重組抗菌肽抑菌活性逐漸減弱，溫度過低(≤28℃)影響融合蛋白的抑菌活性，在37℃培養(yǎng)，重組抗菌肽抑菌活性最好(結(jié)果未列出)。

2.2.2 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)采用不同濃度IPTG (0.05、0.1、0.5、0.8、1.2 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從圖2中可以看出，不同的IPTG 濃度對(duì)融合蛋白表達(dá)量影響不大，當(dāng)IPTG 濃度為0.1 mmol/L 時(shí)融合蛋白表達(dá)量最高，利用Bandscan 軟件分析，HIS-TmAMP1m 融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量36.5%，同時(shí)隨著IPTG 濃度的增加重組抗菌肽抑菌活性也增加，但沒有明顯差異(結(jié)果未列出)。

圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)HIS-TmAMP1m 表達(dá)的影響Fig.1 Influence of induction temperature on the expression of fusion protein HIS-TmAMP1m.M:protein molecular weight marker;1:cell extract of uninduced;2?6:crude cells extracts of E.coli induced,induction temperature 20°C,25°C,28°C,30°C,37°C,respectively.

圖2 IPTG 濃度對(duì)HIS-TmAMP1m 表達(dá)的影響Fig.2 Influence of inducer concentration on the expression of fusion protein HIS-TmAMP1m.M:protein molecular weight marker;1:cell extract of uninduced;2–6:crude cells extracts of E.coli induced,induction concentration 0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,0.5 mmol/L,0.8 mmol/L,1.2 mmol/L,respectively.

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響

融合蛋白HIS-TmAMP1m 誘導(dǎo)表達(dá)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 和8 h，從圖3中可以看出，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，融合蛋白表達(dá)量也逐步增加，之后蛋白表達(dá)量差異不明顯，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4 h 時(shí)，融合蛋白表達(dá)量最高，利用Bandscan軟件分析，HIS-TmAMP1m 融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量38.9%。同時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加重組抗菌肽抑菌活性也增加，到第6 h開始融合蛋白抑菌活性逐漸降低(結(jié)果未列出)。當(dāng)溫度為37℃，IPTG 濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h 時(shí)融合蛋白HIS-TmAMP1m 表達(dá)量最高并抑菌活性最好。

2.3 HIS-TmAMP1m 的純化及鑒定

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HIS-TmAMP1m 表達(dá)的影響Fig.3 Influence of induction time on the expression of fusion protein HIS-TmAMP1m.M:protein molecular weight marker;1:cell extract of uninduced;2?9:crude cells extracts of E.coli induced,induction time 1 h,2 h,3 h,4 h,5 h,6 h,7 h,8 h,respectively.

將含有pET-30a-tmAMP1m 載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，裂解菌體提取總蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量為14 kDa 處獲得明顯的表達(dá)蛋白條帶，與預(yù)期大小相符(圖4A，第2泳道)。經(jīng)過超聲破碎進(jìn)行可溶性分析發(fā)現(xiàn)大部分融合蛋白存在于上清中(圖4A，第3、4泳道)。

按照條件優(yōu)化后，將可溶性形式表達(dá)的融合蛋白利用NTA-Ni 親和層析柱進(jìn)行純化，獲得較純的HIS 融合蛋白(圖4B，第2泳道)。利用HIS單克隆抗體Western blotting 檢測(cè)獲得了相應(yīng)條帶的融合蛋白(圖4C，第1泳道)，證實(shí)了誘導(dǎo)黃粉蟲融合蛋白HIS-TmAMP1m 的正確表達(dá)。

2.4 HIS-TmAMP1m 表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)影響

從圖5可以看出加入IPTG 后BL21轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)在一定程度上受到抑制，結(jié)果表明，融合蛋白HIS-TmAMP1m 的表達(dá)并末完全殺傷宿主本身，使宿主菌生長(zhǎng)受到一定程度抑制。

2.5 HIS-TmAMP1m 的最小抑菌濃度檢測(cè)

圖4 融合蛋白HIS-TmAMP1m 的表達(dá)、純化及鑒定Fig.4 Expression,purification and analysis of HIS-TmAMP1m fusion proteins.(A) Soluble expression of HIS-TmAMP1m proteins in E.coli BL21(DE3).M:protein molecular weight marker;1:cell extract of uninduced;2:cell extract of E.coli induced;3:supernatant of sonicated cells;4:pellet of sonicated cells.(B) Analysis of purified fusion protein HIS-TmAMP1m.M:protein molecular weight marker;1:soluble fraction of sonicated cells;2:purified fusion protein.(C) Western blotting analysis of HIS-TmAMP1m.M:protein molecular weight marker;1:fusion protein.

表1數(shù)據(jù)顯示，黃粉蟲抗菌肽 H I STmAMP1m 對(duì)金黃色葡萄球菌、葡萄球菌、谷氨酸棒狀桿菌、蘇云金桿菌、棒狀桿菌等5種菌有不同程度的殺滅抑制作用，其中抗菌肽對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌作用次之，對(duì)蘇云金桿菌、葡萄球菌、棒狀桿菌的抑菌作用稍弱一些，但還是有良好的抗菌效果。

2.6 HIS-TmAMP1理化性質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)

將濃度為0.076 g/L 融合蛋白HIS-TmAMP1m經(jīng)100℃煮沸10 h后對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示(圖6A 和6B)，煮沸10 h 的抑菌圈與未煮沸的融合蛋白的抑菌圈大小不變，Tricine-SDS-PAGE 顯示檢測(cè)溶液中含有目的蛋白，表明融合蛋白具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

表1 融合蛋白 HIS-TmAMP1m 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定Table 1 Minimum inhibitory concentrations of fusion protein HIS-TmAMP1m against five kinds of strains

圖5 IPTG 誘導(dǎo)后含有pET-30a-tmAMP1m 質(zhì)粒的BL21生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of BL21 with pET-30a-tmAMP1m induced by IPTG.

濃度為0.076 g/L 融合蛋白HIS-TmAMP1m經(jīng)反復(fù)凍融10次、與強(qiáng)酸強(qiáng)堿、不同有機(jī)溶劑和蛋白酶混合后，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，仍然表現(xiàn)出良好的抑菌活性，而設(shè)立的對(duì)照組PBS 緩沖液，pH 4～12的緩沖液、5種有機(jī)溶劑和兩種蛋白酶都未出現(xiàn)抑菌圈(照片未列出)。結(jié)果表明融合蛋白具有很強(qiáng)的反復(fù)凍融穩(wěn)定性(圖7A)，酸堿穩(wěn)定性(圖7B)，有機(jī)溶劑穩(wěn)定性(圖7C)和蛋白酶穩(wěn)定性(圖7D)。

3 討論

抗生素的濫用所造成的細(xì)菌耐藥性在臨床抗感染治療上產(chǎn)生了巨大的壓力，迫切需要尋找一種全新抗菌制劑。抗菌肽憑借其分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有光譜的殺菌活性等特性有望成為最有前景的抗菌候選藥物[10-11]。抗菌肽還能選擇性地殺死入侵的病原微生物，包括耐藥性細(xì)菌，其抗菌作用獨(dú)特。帶正電荷的抗菌肽通過靜電作用結(jié)合在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上并形成離子通道，破壞膜的完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，最后導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄露和細(xì)菌死亡而達(dá)到抑菌效果[12-13]，因此細(xì)菌很難對(duì)抗菌肽產(chǎn)生抗性。董娜等[14]研究了人工合成的β-發(fā)卡抗菌肽對(duì)人紅細(xì)胞的溶血作用，與蜂毒素相比β-發(fā)卡抗菌肽具有更高的細(xì)胞選擇性毒性。雖然抗菌肽具有很大的研究開發(fā)潛力，但它的實(shí)際應(yīng)用存在好多問題。首先是生物體內(nèi)天然抗菌肽含量很低、化學(xué)合成過程繁瑣、難以產(chǎn)業(yè)化、成本高；基因工程手段得到的抗菌肽分子量小并離子型強(qiáng)，因此容易被蛋白酶降解，而且抗菌肽本身的抗菌活性對(duì)宿主菌產(chǎn)生毒害作用[15]。此外，某些抗菌肽的生物學(xué)活性與傳統(tǒng)抗生素相比不夠理想，抗菌肽表達(dá)產(chǎn)物分離和純化較困難。因此，如何提高抗菌肽的表達(dá)效率和抗菌活性，降低成本成為應(yīng)用抗菌肽待解決的問題。

圖6 HIS-TmAMP1m 熱穩(wěn)定性檢測(cè)Fig.6 Thermal stability testing of fusion protein HIS-TmAMP1.(A) Antibacterial activity of fusion protein affected by boiling.1?9:fusion protein was boiled for different time 0 h,10 min,30 min,1 h,3 h,5 h,7 h,9 h,10 h respectively;c:PBS control.(B) Tricine-SDS-PAGE analysis of purified fusion protein affected by boiling.1?9:fusion protein was boiled for different time 0 h,10 min,30 min,1 h,3 h,5 h,7 h,9 h,10 h,respectively;M:protein molecular weight marker.

圖7 融合蛋白HIS-TmAMP1其他穩(wěn)定性檢測(cè)Fig.7 Antibacterial activity of fusion protein HIS-TmAMP1m affected by different conditons.(A) Fusion protein affected by freeze thawing.(B) Fusion protein affected by different pH 4?12:fusion protein treated with buffer of pH 4 to 12;CK:untreated fusion protein.(C) Fusion protein treated with organic solvent.1?5:fusion protein treated with 10% ethanol,10% methanol,10% isopropanol,10% chlorofom,10% N-butanol respectively;CK:untreated fusion protein.(D) Fusion protein affected by protease.1:fusion protein treated with trypsin;2:fusion protein treated with Proteinase K;CK:untreated fusion protein.

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)抗菌肽時(shí)，為獲得表達(dá)量和活性高的抗菌肽，優(yōu)化培養(yǎng)條件非常重要，如：誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間等。本研究通過改變影響外源目的基因的因素，如誘導(dǎo)溫度、IPTG 濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等，分析了HIS-TmAMP1m 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。研究表明，IPTG 濃度低和低溫情況下可以提高可溶性蛋白的表達(dá)量[16]。本研究表明誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)表達(dá)量最高，但活性低，培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)活性很好，溫度過低會(huì)影響目的蛋白的抗菌活性；誘導(dǎo)劑IPTG 濃度對(duì)融合蛋白HIS-TmAMP1m 表達(dá)量及活性影響較少，低IPTG濃度下誘導(dǎo)目的蛋白經(jīng)濟(jì)有效，具備良好的工業(yè)生產(chǎn)前景；誘導(dǎo)表達(dá)4 h 融合蛋白表達(dá)量最高，誘導(dǎo)時(shí)間過短或過長(zhǎng)都會(huì)影響蛋白表達(dá)量。綜合表達(dá)條件優(yōu)化的結(jié)果，確定融合蛋白HIS-TmAMP1m 在大腸桿菌中表達(dá)的最佳表達(dá)條件為37℃、加0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

先前大量研究表明抗菌肽在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)會(huì)對(duì)宿主菌有抑制作用，會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)量。一般采用以融合蛋白形式在大腸桿菌中表達(dá)抗菌肽，有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解，能夠顯著提高其穩(wěn)定性和可溶性，減少對(duì)宿主菌的毒害作用，同時(shí)簡(jiǎn)化后續(xù)的分離純化過程，降低生產(chǎn)成本[17]。周宇荀等[18]研究含抗菌肽Adenoregulin 基因的工程菌的生長(zhǎng)曲線時(shí)，證實(shí)了融合蛋白的形式表達(dá)抗菌肽可以降低其對(duì)宿主菌的毒害作用，未明顯增加宿主菌的代謝負(fù)擔(dān)。畢重朋等[19]和馮志國(guó)等[20]采用融合表達(dá)策略，將抗菌肽基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET32a 上，成功表達(dá)具有抗菌活性的抗菌肽并利用其 His 標(biāo)簽進(jìn)行純化。本研究中Tricine-SDS-PAGE 顯示融合蛋白大小約為14 kDa，以可溶性的形式表達(dá)，易操作。此外，我們利用融合蛋白中C-末端的6×His 標(biāo)簽進(jìn)行親和純化，獲得了較純的目的蛋白，進(jìn)行Western blotting 也出現(xiàn)分子量約14 kDa 的條帶，進(jìn)一步證實(shí)了誘導(dǎo)黃粉蟲抗菌肽HIS-TmAMP1m 的正確表達(dá)。已有研究報(bào)道抗菌肽對(duì)大腸桿菌宿主菌有殺傷作用，如宋杰等[21]和王來城等[22]用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽，融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制，而誘導(dǎo)后的空載質(zhì)粒沒有發(fā)生這種現(xiàn)象，表明抗菌肽對(duì)本身宿主菌產(chǎn)生“自殺現(xiàn)象”。但是，本研究結(jié)果表明黃粉蟲抗菌肽HIS-TmAMP1m 對(duì)宿主菌毒害作用很少，加IPTG 誘導(dǎo)后含有抗菌肽基因的宿主菌的生長(zhǎng)只是在一定程度上生長(zhǎng)受到抑制并未完全殺傷宿主本身，還能穩(wěn)定表達(dá)抗菌肽。

在工藝化生產(chǎn)過程中大量發(fā)酵抗菌肽時(shí)，要求抗菌肽不易失活，抗菌肽的穩(wěn)定性很重要，因此，本研究對(duì)黃粉蟲抗菌肽HIS-TmAMP1m 生物性質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。將濃度為0.076 g/L 的融合蛋白經(jīng)100℃煮沸10 h，在?20℃反復(fù)凍融10次，與強(qiáng)酸強(qiáng)堿緩沖液、不同的有機(jī)溶劑和蛋白酶混合后仍然有極強(qiáng)的抗菌活性，但是陰性對(duì)照組(分別為加強(qiáng)酸強(qiáng)堿緩沖液，有機(jī)溶劑，蛋白酶)沒有出現(xiàn)抑菌活性。研究結(jié)果表明黃粉蟲抗菌肽HIS-TmAMP1m 在高溫、低溫、酸堿、有機(jī)溶劑、蛋白酶環(huán)境中具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。防御素是廣泛存在于機(jī)體體內(nèi)的的一類富含半胱氨酸的陽離子抗微生物肽，屬內(nèi)源性抗微生物肽家族，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起重要的作用[23]。本研究將蛋白TmAMP1m 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲融合蛋白HIS-TmAMP1m 屬于防御素家族(Defensin)，含較多的二硫鍵，以穩(wěn)定抗菌肽的結(jié)構(gòu)[24]，此結(jié)果與抗菌肽具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性是一致的。此外，本研究對(duì)5種細(xì)菌進(jìn)行最小抑制濃度測(cè)定，研究結(jié)果表明黃粉蟲抗菌肽HIS-TmAMP1m 對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌作用次之，對(duì)蘇云金桿菌、葡萄球菌、棒狀桿菌的抑菌作用稍弱一些，但還是表現(xiàn)出良好的抗菌活性。

研究結(jié)果表明黃粉蟲抗菌肽HIS-TmAMP1m 生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)5種菌抑菌效果較好，利用融合蛋白的熱穩(wěn)定性，純化之前將蛋白煮沸0.5 h，離心除去雜蛋白后上柱純化，再用磷酸緩沖液透析并超濾濃縮得到較純的目的蛋白，制備方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)，具有開發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)應(yīng)用前景，對(duì)抗菌肽進(jìn)一步研究有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于抗菌肽的結(jié)構(gòu)、功能以及抗菌機(jī)理還有待深入研究。

[1]Boman HG,Nilsson I,Rasmuson B.Inducible antibacterial defence system in Drosophila.Nature,1972,237:232?235.

[2]Steiner H,Hultmark D,Engstrom A,et al.Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity.Nature,1981,292:246?248.

[3]Guaní-Guerra E,Santos-Mendoza T,Lugo-Reyes SO,et al.Antimicrobial peptides:general overview and clinical implications in human health and disease.Clin Immunol,2010,135(1):1?11.

[4]Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature,2002,415:389?395.

[5]Hoskin DW,Ramamoorthy A.Sudies on anticancer activities of antimicrobial peptides.Biochim Biophys Acta,2008,1778:357?375.

[6]Zhang LF.Antimicrobial peptides prokaryotic expression strategy.Heilongjiang Sci Technol Infor,2010,6:1(in Chinese).張麗芳.抗菌肽原核表達(dá)策略.黑龍江科技信息,2010,6:1.

[7]Hultmark D,Steiner H,Rasmuson T,et al.Purification and properities of three inducible bactericidal proteins from hemo lymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia.Eur J Biochem,1980,106:7?16.

[8]Hultmark D.Quantification of antimicrobial activity,using the inhibition-zone assay//Wiesner A,Dunphy GB,Marmaras VJ,et al,Eds.Techniques in Insect Immunology.Sweden:SOS Publications,Fair Haven Press,1998:103?107.

[9]Ekengren S,Hultmark D.Drosophila cecropin as an antifungal agent.Insect Biochem Molec,1999,29:965?972.

[10]Papagianni M.Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties:biosynthesis,structure,function and applications.Biotechnol Adv,2003,21:465?499.

[11]Hancock RE.Cationic peptides:effectors in innate immunity and novel antimicrobials.Lancet Infect Dis,2001,1:156?164.

[12]Claire LT,Georgios M,Christopher JN,et al.Induction of cationic chicken liver-expressed antimicrobial peptide 2 in response to Salmonella enterica infection.Infect Immun,2004,72(12):6987?6993.

[13]Christtensen B,David M.Channel-formatting properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:5072?5076.

[14]Dong N,Ma QQ,Shan AS,et al.Design and biological activity of β-hairpin-like antimicrobial peptide.Chin J Biotech,2012,28(2):243?250(in Chinese).董娜,馬清泉,單安山,等.β-發(fā)卡抗菌肽的全新設(shè)計(jì)及其生物學(xué)活性.生物工程學(xué)報(bào),2012,28(2):243?250.

[15]Y Li.Recombinant production of antimicrobial peptides in Escherichia coli:a review.Protein Expres Purif,2011,80:260?267.

[16]S?rensen HP,Mortensen KK.Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.Microb Cell Fact,2005,4:1.

[17]Ma QS,Yu ZQ,Han B,et al.Research progress in fusion expression of antimicrobial peptides.Chin J Biotech,2011,27(10):1408?1416(in Chinese).馬青山,余占橋,韓冰,等.抗菌肽融合表達(dá)研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報(bào),2011,27(10):1408?1416.

[18]Zhou YX,Cao W,Wei DZ,et al.Optimization of cultural condition of genetic engineering strain for antibiotic peotide adenoregulin and research on its Fed-batch cultivation.Chin J Biotech,2005,21(4):615?621(in Chinese).周宇荀,曹巍,魏東芝,等.抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及分批發(fā)酵研究.生物工程學(xué)報(bào),2005,21(4):615?621.

[19]Bi CP,Feng XJ,Shan AS,et al.Cloning and expression of a gene encoding shortened LfcinB(1-15)-Melittin(5-12) hybrid peptide in Escherichia coli BL21(DE3).Chin J Biotech,2009,25(7):975?981(in Chinese).畢重朋,馮興軍,單安山,等.牛乳鐵蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12)雜合肽基因的合成及在大腸桿菌中的表達(dá).生物工程學(xué)報(bào),2009,25(7):975?981.

[20]Feng ZG,Lu J,Lang J,et al.Direct expression and purification of glycine-rich antibacterial peptide of Drosophila in Escherichia coli.Bullet Biotechnol,2009,3:88?90(in Chinese).馮志國(guó),陸婕,郎君,等.富甘氨酸果蠅抗菌肽在大腸桿菌中的直接表達(dá)和純化.生物技術(shù)通報(bào),2009,3:88?90.

[21]Song J,Chen WC.Prokaryotic expression and antibacterial activity of Cecropin D from the common cutworm,Spodoptera litura.Acta Entomol Sin,2007,50(12):1207?1211(inChinese).宋杰,陳維春.斜紋夜蛾Cecropin D 成熟肽的原核表達(dá)及活性檢測(cè).昆蟲學(xué)報(bào),2007,50(12):1207?1211.

[22]Wang LC,Wang JX,Zhao XF,et al.Recombinant expression in E.coli,purification and polyclonal antibody preparation of a defensin from the huosefly.Acta Zool Sin,2005,51(2):327?334(in Chinese).王來城,王金星,趙小凡,等.家蠅防御素在大腸桿菌中的表達(dá)、純化與抗體制備.動(dòng)物學(xué)報(bào),2005,51(2):327?334.

[23]Yu XB,Guo CL,Wu CL,et al.Advance in the research of defensins.Prog Vet Med,2006,27(8):47?51(in Chinese).余興邦,郭鎖鏈,烏翠蘭,等.防御素研究進(jìn)展.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(8):47?51.

[24]Zhang LT,Liu ZY,Zhang FC.Progresses of relationship between antimicrobial peptide structure and function as well as its molecular design.Biotechnol,2008,18(5):89?92(in Chinese).張?zhí)m廷,劉忠淵,張富春.抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及分子改造研究進(jìn)展.生物技術(shù),2008,18(5):89?92.