不同粒徑聚苯乙烯微塑料對黃粉蟲的生物毒性研究

李鵬浩,李 哲,王 瓊,馬 怡,牛清雨,郭笑盈*

(1.鄭州大學生態(tài)與環(huán)境學院,河南 鄭州 450001;2.鄭州大學環(huán)境與資源國際聯(lián)合實驗室,河南 鄭州 450001)

21世紀開始,塑料行業(yè)逐漸成為醫(yī)療保健、能源生產(chǎn)、航空航天、汽車、海事、建筑、電子、包裝和紡織等其他經(jīng)濟領(lǐng)域許多產(chǎn)品和技術(shù)創(chuàng)新的關(guān)鍵推動者[1]。全球塑料的生產(chǎn)和使用總產(chǎn)量已經(jīng)從1950年的1.7×106t增至2020年的3.67×108t[2-3]。目前,中國已經(jīng)成為全球最大的塑料生產(chǎn)國和消費國,2020年中國的塑料制品全年產(chǎn)量已達到1.17×108t,占全球塑料產(chǎn)量的32%,其中泡沫塑料制品占比為3.37%,廢棄塑料總量為3.84×107t,再生利用率僅為17.6%[4]。大量的塑料固體廢棄物難以得到合理和有效處置,其中約79%的廢棄塑料堆積在垃圾填埋場或放置于自然環(huán)境中,其中約12%的廢棄塑料被高溫焚化[5-6]。通過各種途徑進入環(huán)境中的塑料垃圾,在風力、紫外線照射、水力沖刷等理化因素的作用下會逐漸老化,分解成更小的塑料碎片,導致了一類新型污染物——微塑料(microplastics,MPs)污染的出現(xiàn)[7]。

微塑料通常被定義為尺寸小于5 mm的不溶于水的有機聚合物固體顆粒[8]。微塑料顏色形狀多種多樣,且大部分密度與水接近,懸浮在水中容易被水生生物誤食,從而進入食物鏈。目前已經(jīng)在超過2 000種海洋生物中檢測到了微塑料,包括一些人類食用的魚類和甲殼類動物[9]。由于小型水生生物具有生長周期短、體型小和易于觀察等優(yōu)點,因此目前關(guān)于微塑料生物毒性研究的模式生物主要集中在小型水生動物,如牡蠣幼蟲、水蚤等[10-11]。

Yang等[12-13]針對黃粉蟲(Tenebriomolitor)對微塑料的生物降解機制進行了系統(tǒng)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃粉蟲腸道內(nèi)的微生物菌群能在24 h內(nèi)快速降解和礦化聚苯乙烯(PS),并且將攝入的PS轉(zhuǎn)化為CO2和生物量;也有一些研究發(fā)現(xiàn)[14-16],黃粉蟲能夠攝食PS泡沫塑料,且其有明顯的生長現(xiàn)象,但對塑料的取食具有選擇偏愛性,較為偏愛取食泡沫化程度較高的塑料,并且對PS的降解能力和降解率最高;Tsochatzis等[17]研究表明,在向黃粉蟲喂食麩皮與PS摻雜的飼料時向飼料中加入H2O,將有助于提高PS的降解率。針對黃粉蟲對PS的潛在降解能力和黃粉蟲攝食PS后腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群及排泄物中PS的降解產(chǎn)物已有研究報道,但關(guān)于不同粒徑聚苯乙烯微塑料顆粒對黃粉蟲生物毒性的研究較少[17-21]。為此,本研究采用黃粉蟲為受試生物,通過向黃粉蟲喂食不同比例的聚苯乙烯(PS)顆粒與麩皮組合以及不同粒徑PS小球,測定試驗周期內(nèi)黃粉蟲生物學指標及組織內(nèi)抗氧化酶水平等參數(shù),探究并分析不同粒徑與不同攝食比例的微塑料對黃粉蟲生命體征和組織水平生物毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 黃粉蟲與聚苯乙烯

試驗所用黃粉蟲(Tenebriomolitor)和麩皮均采購于山東省菏澤市牡丹區(qū)花鳥市場,其中黃粉蟲平均長度為1.5 cm;粒徑為30 μm高密度聚苯乙烯(HDPS)采購于科信達高分子材料有限公司,粒徑為1 mm和4 mm低密度聚苯乙烯(LDPS1、LDPS4)采購于上海文言塑化有限公司。

在試驗開始前,先將黃粉蟲分為10份,每份約350條,分別置于20 cm×12 cm×15 cm的孵育箱,在恒溫培養(yǎng)箱(ZWY-240上海智城分析儀器制造有限公司)中以麩皮馴養(yǎng)3 d,培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為(25±0.2) ℃,一天中16 h照明、8 h避光,避免太陽直射。在試驗開始后,每3 d對黃粉蟲糞便稱重,同時對每組存活的黃粉蟲進行稱重,隨后將孵育箱清理干凈并投加新的飼料。

聚苯乙烯(polystyrene,PS)通常被認為是具有耐久性和非生物降解性的一種常見的塑料產(chǎn)品,主要用于食品包裝、建筑保溫、電子電器設(shè)備、冰箱內(nèi)膽、鏡框等[2]。對本試驗所用的3種聚苯乙烯樣品(HDPS、LDPS1、LDPS4)進行了傅里葉紅外光譜掃描(Frontier,美國PekinElmer有限公司),通過特征官能團以確認塑料類型;利用掃描電子顯微鏡(Nova Nona 450,美國FEI有限公司)觀察高密度聚苯乙烯樣品(HDPS,粒徑為30 μm)的微觀表面狀態(tài);利用表面積和孔徑分析儀(ASAP2460,上海麥克莫瑞提克有限公司)測定高密度聚苯乙烯樣品(HDPS,粒徑為30 μm)的比表面積和孔容。

1.2 黃粉蟲飼養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)記錄

本試驗將挑選出大小較一致的黃粉蟲(長度為13～16 mm)隨機分為5組,每組設(shè)2個平行試驗,每個平行試驗初始黃粉蟲數(shù)量約350條(圖1),整個試驗過程中黃粉蟲的飼養(yǎng)條件見表1。

表1 黃粉蟲飼養(yǎng)條件

圖1 試驗開始時的黃粉蟲Fig.1 Tenebrio molitor at the beginning of the experiment

根據(jù)預試驗飼養(yǎng)經(jīng)驗,本試驗中黃粉蟲的馴養(yǎng)期為3 d,培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為(25±0.2) ℃,一天中16 h照明、8 h避光,隨后開始為期24 d的試驗,其中麩皮對照組(FP)、10% HDPS混合組(HPS10)和25% HDPS混合組(HPS25)需每3 d投喂2 g相應配比的飼料,而1 mm LDPS單一組(LPS1)和4 mm LDPS單一組(LPS4)兩組的塑料小球消耗較慢,因此只需在第一次投喂時足量投加微塑料。本試驗以6 d為一個時間周期,統(tǒng)計各個時間周期內(nèi)每組黃粉蟲的攝食量、排泄量、蛻皮量、死亡量。

1.3 黃粉蟲生物組織內(nèi)抗氧化酶水平測試

黃粉蟲生物組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)的含量均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒進行測定。勻漿液提取過程中用到的所有耗材提前預冷,試驗過程中使用的泡沫箱加冰預冷。從各個組中分別隨機取20條黃粉蟲,稱重后置于50 mL塑料離心管中,用去離子水將黃粉蟲潤洗干凈,然后用濾紙擦干黃粉蟲體表殘余的水,隨后將黃粉蟲直接制備成勻漿液進行分析。未能及時進行勻漿制備的黃粉蟲儲存于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi),以確保黃粉蟲生物組織內(nèi)抗氧化酶水平穩(wěn)定。

試驗采用低溫研磨的方法制備勻漿液,先取清洗干凈的黃粉蟲(或-80 ℃保存下的黃粉蟲)放置于提前預冷的80 mL滅菌燒杯中,按1∶9 (w/v)加入預冷生理鹽水;然后用解剖剪將20條黃粉蟲剪成約2 mm長的小段,隨后立刻轉(zhuǎn)移至10 mL勻漿管上下抽提研磨1 min至溶融狀態(tài),勻漿時將勻漿管置于冰水浴中,以減少勻漿過程中的物理摩擦放熱對酶活性的抑制,并將研磨液全部轉(zhuǎn)移至5 mL塑料離心管內(nèi);最后使用低溫離心機在4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min,將上清液平分成3份,每份約1.5～2.0 mL倒入微型離心管中,隨后直接進行分析測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚苯乙烯(PS)的形貌表征與理化屬性

本試驗所用到的3種聚苯乙烯微塑料(HDPS、LDPS1、LDPS4)樣品的傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)圖,如圖2所示。

圖2 3種聚苯乙烯微塑料(HDPS、LDPS1、LDPS4)樣品的 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)圖Fig.2 FT-IR spectra of three polystyrene samples (HDPS, LDPS1,and LDPS4)

由圖2可以看出:3種聚苯乙烯(HDPS、LDPS1、LDPS4)樣品在3 102～3 002 cm-1處均有明顯的吸收峰,對應聚苯乙烯分子中大量C—H鍵的伸縮振動;樣品在2 925 cm-1處有明顯的吸收峰,對應聚苯乙烯分子中CH2不對稱伸縮振動;樣品在1 601～1 451 cm-1處的吸收峰屬聚苯乙烯苯環(huán)骨架振動模式;樣品在1 027 cm-1和750 cm-1處的紅外吸收峰,分別對應聚苯乙烯分子中苯環(huán)上C—H面內(nèi)和面外彎曲振動模式。

FT-IR分析結(jié)果表明,本試驗所用的所有聚苯乙烯微塑料樣品均符合聚苯乙烯分子結(jié)構(gòu)的紅外特征吸收峰[22]。

粒徑為30 μm的高密度聚苯乙烯(HDPS)樣品的掃描電鏡(SEM)圖,如圖3所示。

圖3 粒徑為30 μm的高密度聚苯乙烯(HDPS)樣品的掃 描電鏡圖Fig.3 SEM of 30 μm high-density polystyrene (HDPS) microplastic samples

由圖3可以看出:HPS10組和HPS25組使用的HDPS樣品呈現(xiàn)出規(guī)則的球體形態(tài),表面光滑無裂痕;HDPS樣品的比表面積為3.733 m2/g,孔容為0.008 cm3/g,LDPS1和LDPS4樣品未能測出有效比表面積?？梢?相比于傳統(tǒng)碳材料和生物炭,聚苯乙烯微塑料的比表面積和微孔孔容較小[23-24]。

2.2 黃粉蟲生長情況

在整個黃粉蟲飼養(yǎng)過程中,每周期(6 d)對每組存活黃粉蟲進行稱重,記錄存活黃粉蟲總質(zhì)量,見圖4。此外,還考察了黃粉蟲在飼養(yǎng)過程中的死亡量、蛻皮量、排泄量、累計聚苯乙烯攝食量,見圖5至圖8。

圖4 不同試驗組存活黃粉蟲總質(zhì)量隨時間的變化Fig.4 Total mass of surviving Tenebrio molitor in different experimental groups over time

圖5 不同試驗組黃粉蟲死亡量隨時間的變化Fig.5 Mortality of Tenebrio molitor deaths in different experimental groups over time

由圖4和圖5可以看出,

1) 試驗開始時,每組存活黃粉蟲總質(zhì)量控制在(8.35±0.55) g,FP組存活黃粉蟲總質(zhì)量在前3個周期(第0～18天)穩(wěn)定在7.99～8.20 g之間(第18天存活約320條),每周期黃粉蟲死亡量穩(wěn)定在(10.5±1.5)條;從FP組存活黃粉蟲總質(zhì)量的穩(wěn)定和黃粉蟲死亡量來看,在合適的飼養(yǎng)條件下,每周期黃粉蟲會有(3.11±0.54)%的自然死亡,而在去除掉死亡的黃粉蟲后,其總質(zhì)量依舊穩(wěn)定,表明單條存活黃粉蟲質(zhì)量在增加,黃粉蟲整體生長態(tài)勢良好。

2) HPS10組存活黃粉蟲總質(zhì)量在前3個周期表現(xiàn)出與FP組存活黃粉蟲總質(zhì)量相同的趨勢,但從第4周期(第19～24天)開始HPS10組存活黃粉蟲總質(zhì)量有明顯下降;在第4周期結(jié)束時(第24天)HPS10組存活黃粉蟲總質(zhì)量較開始時減少15.3%,而FP組存活黃粉蟲總質(zhì)量只減少了8.8%。相比于HPS10組,HPS25組黃粉蟲飼料中增加了15%的HDPS含量,存活黃粉蟲總質(zhì)量表現(xiàn)出明顯的下降趨勢,從試驗開始時的8.5 g,降低至第3周期末(第18天)的7.4 g,第4周期結(jié)束時(第24天)存活黃粉蟲總質(zhì)量只有6.37 g,相比于試驗開始時減少了25.1%。由此可見,在有麩皮的飼養(yǎng)條件下,低濃度HDPS的添加(HPS10組)在短時間內(nèi)對黃粉蟲的生長并無明顯的影響,而高濃度HDPS的添加(HPS25組)表現(xiàn)出了對黃粉蟲生長的抑制作用。徐世才等[25]研究發(fā)現(xiàn),不同麩皮與泡沫塑料的喂食比例會影響黃粉蟲的生長情況,不同泡沫塑料與麩皮喂食的比例下黃粉蟲的生長呈現(xiàn)拋物線的趨勢,泡沫塑料與麩皮的喂食比例為1∶6時(泡沫塑料占比為14.28%)泡沫塑料的降解率最大,且與純麩皮喂食黃粉蟲的生長情況無差別;Lou等[20]的研究也表明,PS與麩皮喂食的比例為1∶7時將有助于黃粉蟲的生存和生長。本試驗中HPS10組黃粉蟲同樣表現(xiàn)出較好的生長趨勢,通過對試驗周期內(nèi)每天黃粉蟲的死亡數(shù)量進行單因素方差分析,結(jié)果顯示FP組與HPS10組之間無明顯差異(p>0.05),而FP組與HPS25組之間黃粉蟲的生長情況有顯著差異(0.01

3) LPS1和LPS4組相較于其他組,其存活黃粉蟲總質(zhì)量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢,同時黃粉蟲死亡量也更多。在不添加麩皮的條件下,只喂食LDPS,根據(jù)圖8,黃粉蟲在整個試驗過程中攝食的累計LDPS量僅為0.051 g(LPS1組)和0.034 g(LSP4組)。黃粉蟲在取食整塊立方體形狀且邊緣易于附著的聚苯乙烯泡沫塑料時,其啃食降解率能達到99.3%[26]。此外,聚苯乙烯塑料的硬度及表面粗糙程度也與黃粉蟲的取食速率有關(guān)[27]。黃粉蟲能夠降解聚苯乙烯,可能是其腸道內(nèi)微生物的作用,而不是黃粉蟲自身分泌的酶在作用[13,28]。本試驗中黃粉蟲對聚苯乙烯攝食量低的原因可能是由于聚苯乙烯顆粒小球粒徑超過了黃粉蟲的口徑,而且試驗所用的聚苯乙烯小球表面較為光滑,黃粉蟲難以附著在聚苯乙烯小球上,且啃食較為困難。同時,在缺少食物的條件下,黃粉蟲之間存在互相殘殺的現(xiàn)象,因此導致存活黃粉蟲總質(zhì)量不斷減少,其死亡量不斷增加[14,29]。

由圖6可以看出:在有麩皮的飼養(yǎng)條件下,FP、HPS10和HPS25三組黃粉蟲的蛻皮量與飼養(yǎng)時間之間呈現(xiàn)出正相關(guān)性(p<0.05),這是由于黃粉蟲在其幼蟲生長階段會蛻皮,以適應體型的增長,其蛻皮量也從側(cè)面反映了黃粉蟲生長的趨勢;只添加LDPS的兩組黃粉蟲的蛻皮量整體呈現(xiàn)下降的趨勢,這是由于黃粉蟲在沒有麩皮的飼養(yǎng)條件下只攝食LDPS,但攝入量較少(圖8),整組黃粉蟲攝入能量較少,黃粉蟲自身的生長受到了限制,因此黃粉蟲在蛻皮量上也表現(xiàn)出整體下降的趨勢。

圖6 不同試驗組黃粉蟲蛻皮量隨時間的變化Fig.6 Molting amount of Tenebrio molitor in different experimental groups over time

圖7 不同試驗組黃粉蟲排泄量隨時間的變化Fig.7 Excretion amount of Tenebrio molitor in different experimental groups over time

圖8 不同試驗組黃粉蟲累計聚苯乙烯攝食量隨時間的 變化Fig.8 Cumulative microplastic intake of PS by Tenebrio molitor in different experimental groups over time

由圖7可以看出:在黃粉蟲排泄量上,并非是FP組的黃粉蟲排泄量最高, 而是HPS25組黃粉蟲的排泄量最高,這可能是因為黃粉蟲攝食含有高濃度HDPS(HPS25組)的麩皮飼料后,黃粉蟲對HDPS的消化不完全,其中47.7%轉(zhuǎn)化為CO2,49.2%隨糞便排出,因此導致其排泄量更高[12-13];LPS1和LPS4組黃粉蟲的排泄量高于攝入的LDPS質(zhì)量,這可能是因為在缺少食物的條件下,黃粉蟲之間互相啃食,死亡黃粉蟲被存活黃粉蟲當作食物吞食[29]。雖然在試驗過程中每天將死亡黃粉蟲挑出,避免存活黃粉蟲吞食死亡黃粉蟲,但難免會有少量吞食情況發(fā)生。

2.3 黃粉蟲生物組織內(nèi)抗氧化酶水平

活性氧物質(zhì)是指含氧原子的自由基,是由氧通過直接或者間接的方式轉(zhuǎn)變而來,包括氧自由基及其衍生物兩大類。正常狀態(tài)下,機體產(chǎn)生的自由基和清除自由基的速率處于動態(tài)平衡狀態(tài),而當外源性因素物質(zhì)的干擾打破這種平衡時,活性氧便會持續(xù)累積產(chǎn)生,增加到一定水平時就會對機體的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等大分子造成損傷[30]。活性氧物質(zhì)的生成被認為是微塑料毒性的主要致毒機理。

在試驗的第4周期末(第24天),對黃粉蟲組織內(nèi)抗氧化酶水平進行了測試,其測試結(jié)果見圖9。

注:柱狀圖內(nèi)每個柱形圖上部的字母a、b、c是差異性分析的結(jié)果,相同字母表示它們之間的差異性不顯著(p>0.05),不同字母表示它們之間的差異性顯著(p<0.05)。圖9 不同試驗組黃粉蟲生物組織內(nèi)抗氧化酶水平對比Fig.9 Antioxidant enzyme levels in Tenebrio molitor tissue in different experimental groups

由圖9可以看出:

1) 在有麩皮飼養(yǎng)條件下,黃粉蟲生物組織內(nèi)SOD、GPx水平相對較低,將有麩皮HDPS組(HPS10、HPS25)與純LDPS組(LPS1、LPS4)飼養(yǎng)條件下黃粉蟲組織內(nèi)CAT 水平進行方差分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間并無顯著差別(p>0.05);相較于FP組,LPS1和LPS4組黃粉蟲生物組織內(nèi)SOD水平分別升高了2.21倍和1.87倍,GPx水平分別升高了3.55倍和3.65倍,黃粉蟲生物組織內(nèi)SOD和GPx水平的顯著升高可能是黃粉蟲攝食LDPS導致的,也可能是由于沒有麩皮,攝食的食物過少引起的,故未來在試驗中應考慮完全不喂食的條件下黃粉蟲生物組織內(nèi)SOD、GPx的水平。

2) 通過對比純麩皮(FP)飼養(yǎng)與麩皮摻雜HDPS(HPS10、HPS25)飼養(yǎng)條件發(fā)現(xiàn),黃粉蟲組織內(nèi)SOD、GPx和CAT水平無明顯差異(p>0.05),表明黃粉蟲在有正常食物來源的情況下,攝食一定量的PS對其自身生物毒性的影響較少;但麩皮摻雜HDPS的飼養(yǎng)條件下,黃粉蟲生物組織內(nèi)丙二醛(MDA)水平有顯著升高(p<0.05)(圖10)。生物組織內(nèi)MDA的濃度變化可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度,進而反映細胞受損程度[33-34]。 Tsochatzis等[35]研究發(fā)現(xiàn),黃粉蟲攝食含PS的麩皮飼料后,黃粉蟲生物組織內(nèi)關(guān)于細胞凋亡的生物標志物神經(jīng)酰胺和心磷脂濃度較高,表明黃粉蟲可以代謝PS,但會導致其應激水平增加。本研究中HPS10和HPS25組黃粉蟲生物組織內(nèi)MDA水平的顯著升高同樣表明黃粉蟲攝食PS后對機體細胞有一定的損傷。

圖10 不同試驗組黃粉蟲生物組織內(nèi)丙二醛(MDA)水平 對比Fig.10 Malondialdehyde levels within Tenebrio molitor tissue in different experimental groups

3 結(jié) 論

1) 粒徑是影響黃粉蟲攝食聚苯乙烯(PS)的重要因素之一,黃粉蟲對1 mm和4 mm粒徑的PS小球攝食量較小,而在麩皮與HDPS摻雜的飼養(yǎng)條件下,黃粉蟲能攝食較多的PS,且死亡量低。

2) 喂食黃粉蟲摻雜了10%和25%HDPS的麩皮飼料,其中含有25%的HDPS會對黃粉蟲的生長產(chǎn)生抑制作用。攝食含有25%的HDPS黃粉蟲的排泄量為最高,這可能是由于黃粉蟲攝食到體內(nèi)的HDPS并不能完全被分解而導致。

3) 在有麩皮飼養(yǎng)的條件下,黃粉蟲攝食PS對其自身生物毒性的影響較小,但還是會對其存在一定的細胞損傷。