不同劑量順鉑誘導(dǎo)小鼠卵巢功能早衰程度的差異＊

羅 嬌，張小雨，王鈺瑩，楊 進(jìn)，范振海，余麗梅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563099)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是由多種病因引起的卵巢功能衰竭，在女性人群中的發(fā)病率為1%［1］。POF病人可出現(xiàn)明顯的內(nèi)分泌失調(diào)，典型變化為卵巢功能衰竭、卵巢萎縮，體內(nèi)雌激素水平低下和高促性腺激素，卵巢組織退行性變化的加速，臨床表現(xiàn)為原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕、潮熱多汗、陰道干澀、骨質(zhì)疏松等［2］，雌激素替代治療為目前的主要治療措施，但通常不能使POF患者得到根本改善，最終導(dǎo)致POF患者衰老加速。建立一種理想可靠的POF動物模型，對于POF發(fā)生、發(fā)展及其機(jī)制及其治療研究尤顯重要。本實(shí)驗(yàn)使用不同劑量順鉑(cisplatin or cis－diamminedichloroplatinum，CDDP)誘導(dǎo)小鼠化療損傷性卵巢功能早衰［3］，以期獲得卵巢損傷較穩(wěn)定，死亡率低、模型制備成功率高的藥物損害性POF模型，為進(jìn)一步探討卵巢早衰的發(fā)生、發(fā)展以及防治等臨床前研究提供合理的動物模型。

1 材料

1.1 動物 雌性ICR小鼠(6～8周)80只，體重28～30 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，使用許可證編號:SCXK(京)20022 0001，21～25℃條件喂養(yǎng)，相對濕度50% ～70%，每日光照12 h，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后連續(xù)5 d，進(jìn)行陰道涂片，將動情周期正常的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 CDDP，粉針劑，10 mg/支(海南齊魯制藥)，采用生理鹽水配制成實(shí)驗(yàn)濃度0.5 mg/mL分裝，避光存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 分組和模型制備 ICR小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只。正常組小鼠每天腹腔注射生理鹽水;模型1組:首次腹腔注射CDDP 3.0 mg/kg，接下6 d給予CDDP 2.0 mg/kg;模型2組:前3 d腹腔注射 CDDP 3.0 mg/kg，余下 4 d 給予 CDDP 2.0 mg/kg;模型3 組，連續(xù)7 d 給予 CDDP3.0 mg/kg，以上各組均從小鼠左側(cè)腹股溝上方腹腔注射藥均，并于停藥24 h后每組取材10只小鼠，剩余小鼠觀察其存活與動情周期恢復(fù)情況。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 一般狀態(tài) 小鼠的飲食、活動、大小便情況，每日稱量體重，并記錄。

2.2.2 動情周期 每天上午8∶30行小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片HE染色，光鏡下觀察小鼠動情周期變化。2.2.3 卵巢組織形態(tài)學(xué) 處死小鼠后，取留卵巢、子宮，常溫下4%多聚甲醛固定過夜，送遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 CDDP對小鼠一般活動的影響 與正常組比較，模型1、2、3組小鼠在注射CDDP后，出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，攝食、活動減少，皮毛豎立，光澤度下降，且大便偏稀、較少。模型組小鼠均從給藥第3天開始體重逐漸下降，模型1組小鼠第5天后的體重下降差異具有顯著性(P＜0.05)，模型2、3組則于第4天開始體重下降差異具有顯著性(P＜0.01)，模型1、模型2、模型3組之間比較，以模型3組體重下降幅度最大(P＜0.05)。正常組小鼠全部存活，模型1組小鼠停止CCDP注射第3天有1只小鼠死亡，模型2組小鼠在停藥第2天死亡2只，兩組死亡率分別為10%和20%;模型3組小鼠給藥結(jié)束當(dāng)日死亡1只，之后5日小鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡率達(dá)70%，與模型2組死亡率比較有顯著性差異(P0.05，1=0.35 ＜ 0.05);其余小鼠在注射順鉑結(jié)束14 d的觀察期內(nèi)均存活。

圖1 不同劑量CCDP對POF小鼠體重的影響

3.2 動情周期觀察 每日陰道涂片檢測小鼠動情周期。正常小鼠的動情周期為4～5 d，包括動情前期、動情期、動情后期和動情間期。給CDDP期間，模型1、2、3組則出現(xiàn)明顯周期紊亂，表現(xiàn)為動情后期和動情間期延長，少見動情前期和動情期。CDDP注射結(jié)束后14 d，模型1組有50%(5/10)小鼠恢復(fù)正常動情周期，模型2組僅有1只小鼠恢復(fù)正常動情周期，而模型3組動情周期持續(xù)紊亂;與正常組比較，模型1、2、3組小鼠動情周期紊亂發(fā)生率均明顯升高(=16.81，P ＜0.01)。

圖2 ICR小鼠動情周期各期HE染色涂片(×100)

3.3 CDDP改變卵巢組織形態(tài)學(xué) 如圖3所示，正常小鼠卵巢外表光滑、紅潤，腹腔注射CDDP后，卵巢體積縮小，表面無光澤，有一定程度的皺縮，色較白。常規(guī)石蠟切片、HE染色后，光鏡下觀察(見圖4)，正常小鼠卵巢可見各級卵泡，發(fā)育較成熟卵泡位于與卵巢組織周邊位置，卵母細(xì)胞形態(tài)均一，較圓，透明帶清晰光滑，周邊顆粒細(xì)胞排列整齊，呈放射狀層疊排列。模型組卵巢組織則呈現(xiàn)不同程度的較多空泡樣改變，卵泡閉鎖和間質(zhì)纖維化樣改變，卵泡內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤。模型1組卵巢壞死細(xì)胞較少，可見成熟卵泡，形態(tài)結(jié)構(gòu)較好，而模型2、3組卵巢組織結(jié)構(gòu)紊亂，閉鎖卵泡明顯增加，各級典型卵泡明顯減少，偶見雜亂排列的較成熟卵泡，尤其是模型3組基本見不到發(fā)育成熟的卵泡細(xì)胞，罕見個別較成熟卵泡，其細(xì)胞體積極小，有細(xì)胞核固縮現(xiàn)象，卵母細(xì)胞周圍透明帶不明顯，核顆粒細(xì)胞僅見稀疏的1～2層、雜亂排列。

4 討論

CDDP是臨床用于治療腫瘤的常用藥物之一，作用似烷化劑，主要是通過干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制，或與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合，達(dá)到腫瘤治療效果。CDDP在抗腫瘤的同時，也對機(jī)體產(chǎn)生明顯副作用［4］。研究報道，高濃度的CDDP即可抑制卵巢顆粒細(xì)胞生長，也可誘導(dǎo)其凋亡，從而明顯抑制卵巢功能［5－6］，使卵泡發(fā)育受阻，進(jìn)而發(fā)展為排卵減少，雌激素水平低下，最終導(dǎo)致POF。

鑒于引起POF病因的多樣性，目前在科研中，已建立的POF模型主要包括化學(xué)毒物誘導(dǎo)、化療藥物損傷、基因敲除、免疫性POF模型和雙氧水局部損傷模型等［7－9］，其中連續(xù)腹腔注射CDDP為常用的POF模型制備方法，所誘導(dǎo)的癥狀、激素水平與病理變化與臨床所見的抗腫瘤化療所致的POF極為相似［10］，除表現(xiàn)為血清低雌激素、高促性腺激素水平外［11］，卵巢組織病理學(xué)等也比較符合臨床化療后出現(xiàn)的 POF［12－13］，且 CDDP 致 POF 模型費(fèi)用低廉，成模時間短等特點(diǎn)，即適用于化療所致POF的機(jī)制及防治研究，亦可用于CDDP的藥理與毒理學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，腹腔注射較高劑量CDDP后，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、皮毛光澤度下降、動情周期紊亂，卵巢外觀體積縮小，組織HE染色所觀察到的卵巢組織結(jié)構(gòu)紊亂，空泡樣改變，發(fā)育卵泡數(shù)量的明顯下降，少見成熟卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層減少，閉鎖卵泡增多，間質(zhì)纖維化樣改變，濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，與文獻(xiàn)報道一致［14］。但文獻(xiàn)中所用CDDP劑量差異較大，常見劑量為1～3 mg/kg，多采用3 mg/kg連續(xù)腹腔注射5～7 d不等，但所致的卵巢損害程度與動物存活率的差異不明確，因而導(dǎo)致疾病改變及其治療研究出現(xiàn)了一些不一致或難以闡釋的現(xiàn)象;3 mg/kg連續(xù)腹腔注射7 d，動物死亡率高，卵巢及其他組織器官損傷嚴(yán)重也是一個突出問題。實(shí)驗(yàn)中參照艾浩等的方法［3］，以2.0 ～3.0 mg/kg 3 種給藥方案，不同 CDDP總給藥量，分別設(shè)立3個模型組，結(jié)果顯示，模型組1小鼠卵巢損傷相對較輕，卵巢組織仍可見成熟卵泡，停藥后動情周期可自行恢復(fù)正常;模型組3小鼠卵巢損傷較重，動物死亡率高，卵巢組織基本見不到發(fā)育成熟的卵泡，且14 d內(nèi)小鼠動情周期的紊亂難以恢復(fù);模型組2前3 d給予CDDP 3 mg/kg，后4 d 給藥 2.0 mg/kg，小鼠出現(xiàn)了動情周期紊亂和POF的卵巢組織相應(yīng)組織病理學(xué)變化，但死亡率明顯低于模型3組。由此可見，采用模型2組方案制備ICR小鼠POF，病理生理與組織病理學(xué)改變明顯，組織損傷較為穩(wěn)定，又不至引起過高的動物死亡，也至于導(dǎo)致有效治療措施難發(fā)揮作用，更適用于探討POF發(fā)病機(jī)制研究或治療方案的評價。

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