MicroRNA在晚期大腸癌一線化療療效中的預測作用

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

MicroRNA在晚期大腸癌一線化療療效中的預測作用

胡勁松 蔡三軍

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：大腸癌是一種高發(fā)病率的惡性腫瘤，化療可以減少腫瘤的生長和復發(fā)。當前較為重要的是探究標志物能夠預測化療耐藥標志物，從而幫助確定治療方案。方法：選取2007年11月—2010年5月復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科Ⅳ期大腸癌患者手術(shù)標本，術(shù)后患者都使用大腸癌術(shù)后規(guī)范化一線化療(希羅達+奧沙利鉑)。選取化療耐藥與有效癌組織標本各3例共6例使用microRNA芯片檢測。篩選出有統(tǒng)計學意義的miRNA：miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p和miR-939，將候選miRNA在100例Ⅳ期大腸癌患者手術(shù)癌組織標本中進行real-time PCR驗證。結(jié)果：通過芯片篩選，共5個miRNA可能與大腸癌一線化療耐藥有關。miR-4299和miR-196b對化療耐藥有顯著診斷意義。miR-4299的AUC為0.784，而miR-196b的AUC為0.647。兩個聯(lián)合診斷AUC為0.848，敏感度和特異度分別為67.9%和90.9%。結(jié)論：miR-4299和miR-196b有可能作為診斷對大腸癌一線化療耐藥的標志物。

大腸癌；化療；標志物；miR-4299；miR-196b

MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于多種生物體內(nèi)的長度約18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，具有調(diào)節(jié)基因表達的功能。它和mRNA存在互補序列，通常導致翻譯的抑制和基因的沉默。異常的miRNAs表達和很多疾病密切相關，miRNA的失調(diào)也和很多類型腫瘤有密切關系［1-2］。miRNA參與細胞增殖、分化和凋亡等多種重要細胞活動的調(diào)控。miRNA基因以多種形式存在于基因組中，近來研究發(fā)現(xiàn)miRNA能控制蛋白的表達，miRNA修飾表達能影響藥物治療效果［3］。大腸癌是我國最常見的消化系惡性腫瘤之一，化療是進展期大腸癌治療的重要臨床措施［4］。以手術(shù)為主的多學科綜合治療已經(jīng)得到廣泛的認同，全身化療越來越受到重視，其目的是消滅患者體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移灶，增加治愈機會，以延長患者生命，改善生活質(zhì)量。本課題通過對Ⅳ期大腸癌組織標本miRNA表達譜的研究，獲得對一線化療希羅達+奧沙利鉑(XELOX)耐藥診斷的miRNA，探討其與臨床病理特征的關系，為大腸癌患者制定個體化化療方案提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2007年11月—2010年5月在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科行原發(fā)病灶切除術(shù)的Ⅳ期大腸癌患者的手術(shù)標本100例，術(shù)后進行了規(guī)范標準的一線XELOX方案化療。本課題分為兩部分，第一部分在100例患者中配對選擇對化療耐藥和有效標本各3例，共6例。第二部分為驗證部分，共100例患者癌組織標本，分為耐藥組和有效組。

1.2 試劑

總RNA提取使用mirvana miRNA Isolation kit (Ambion，USA)，miRNA表達譜使用Agilent human miRNA v162.0 (Agilent technologies，Santa Clara，CA，US)。miRNA擴增和逆轉(zhuǎn)錄使用cDNA Synthesis Kit(EXIQON，Denmark)，Master Mix(EXIQON，Denmark)。

1.3 方法

1.3.1 化療后評估標準及分組治療反應依據(jù)RECIST(version1.0)

每9周進行臨床和CT檢查，按照化療后評估標準分為部分緩解(partial response，PR)和完全緩解(cmplete response，CR)，并歸為有效組(n=43)；穩(wěn)定(stable disease，SD)和進展(progressive disease，PD)歸為耐藥組(n=57)，所有CT檢查都由同一檢查者評估。

1.3.2 大腸癌miRNA基因芯片表達檢測及RTPCR

所有組織標本為我院標本庫-80 ℃冰箱保存，研究者對實驗標本采用雙盲。總RNA提取使用miRNA Isolation kit。結(jié)果測定使用NanoDrop ND-1000分光光度計。miRNA表達譜使用Agilent human miRNA v162.0［5］。芯片共有探針1 367個，表達對照為各研究組織標本中的U6含量。根據(jù)miRNA芯片結(jié)果共選擇5個有統(tǒng)計學差異的miRNA進行大樣本驗證，使用RT-PCR［6］，首先使用miRNA Isolation kit在組織標本中提取總RNA，測定各組總RNA的濃度，然后轉(zhuǎn)錄與擴增使用cDNA synthesis kit和Mix，共40個循環(huán)的PCR擴增。反應體系(共10 μL)：Master Mix 5 μL，Primer Forward (1 μmol)1 μL，Primer Reverse(1 μmol)1 μL，DNA 1 μL，MiliQ 2 μL。兩步法擴增條件：95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。所有數(shù)據(jù)以各研究組織標本中的U6為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物取10 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增條帶大小。所有RT-PCR重復3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 分析軟件(SPSS，Inc，Chicago，IL)處理。對不同組間比較使用Mann-Whitney U檢驗或者Kruskall-Wallis檢驗。ROC曲線評判診斷價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

耐藥組57例患者以結(jié)腸癌為多，中分化腺癌和低分化腺癌為主；腫瘤組織全部侵入漿膜或漿膜外；1～3枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，3枚以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。TNM分期：全部為Ⅳ期，其中肝轉(zhuǎn)移48例，肺轉(zhuǎn)移7例。有效組43例患者以直腸癌為多，中分化腺癌為主；腫瘤組織全部侵入漿膜或漿膜外；1～3枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，3枚以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。TNM分期：全部為Ⅳ期，其中肝轉(zhuǎn)移29例，肺轉(zhuǎn)移15例。兩組患者在性別、年齡、標本部位方面差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但在肺轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007，表1)。

表 1 大腸癌患者臨床資料Tab. 1 Clinicopathological factors of colorectal cancer patients

2.2 大腸癌miRNA基因芯片表達

選取化療耐藥(耐藥組n=3)和化療有效(有效組n=3)共6例使用miRNA基因芯片檢測(圖1)。miRNA基因芯片共有探針1 367個，其中人miRNA探針共1 200個，共發(fā)現(xiàn)5個差異有統(tǒng)計學意義的miRNA。分別為miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-939、miR-455-3p，其中miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p在耐藥組中低表達，miR-4299、miR-939在耐藥組中高表達(表2)。

2.3 miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-939和miR-455-3p在大腸癌中的表達

通過RT-PCR驗證研究miRNA在大腸癌中的表達，研究分兩組，耐藥組和有效藥組共100例。miR-4299耐藥組為5.51±4.78，有效組為1.90±2.41。miR-196b耐藥組為10.67±7.72，有效組為20.74±26.47。miR-324-5p耐藥組為0.33±1.18，有效組為0.58±0.88。miR-455-3p耐藥組為1.29±3.49，有效組為3.00±4.93。miR-939耐藥組為2.65±13.04，有效組為0.10±0.39。兩組miR-4299和miR-196b的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，miR-324-5p、miR-939和miR-455-3p的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

圖 1 大腸癌miRNA基因芯片圖Fig. 1 Dysregulation of miRNA in human mCRC by the miRNA profiling analysis

圖 2 差異性miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p和miR-939在有效組合耐藥組中的散點圖Fig. 2 Dots indicate of the relative quantification (RQ) values of miR-4299, miR-196b, miR-324-5p, miR-455-3p and miR-939 expression levels, normalized by U6

表 2 對一線化療(希羅達+奧沙利鉑)耐藥組和敏感組比較差異miRNA表達Tab. 2 Significant dysregulation of miRNAs in chemoresistant CRCs

2.4 miR-4299和miR-196b對耐藥大腸癌診斷的價值

ROC曲線分析表明，miR-4299的AUC為 0.784(95% CI：0.670 ～0.897)，miR-196b的AUC為0.647(95%CI：0.508～0.786)，表明miR-4299對耐藥大腸癌有較好的診斷價值。根據(jù)ROC曲線獲得miR-4299的截斷值為1.459，敏感度為71.4%，特異度為88.6%(圖3A)。miR-196b的截斷值為9.454，敏感度為64.3%，特異度為65.9%(圖3B)。miR-4299聯(lián)合miR-196b的AUC為0.848 (95% CI：0.756～0.941)，敏感度為67.9%，特異度為90.9%(圖3C)，能進一步提高對耐藥大腸癌的診斷價值。

圖 3 miR-4299 、miR-196b 、miR-4299 +miR-196b的 ROC曲線分析圖Fig. 3 Receiver operating characteristics (ROC) curve analysis using miR-4299 and miR-196b for discriminating colorectal tumors of chemoresistance

3 討 論

大腸癌為常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，治療主要以手術(shù)為主的綜合性治療。而手術(shù)患者中約50%在術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移。術(shù)前新輔助化療可降低大腸癌分期、改善術(shù)式選擇、提高近期療效；術(shù)后化療可抑制大腸癌復發(fā)、治療腫瘤轉(zhuǎn)移。Tournigand等［7］的一項Ⅲ期隨機研究顯示，化療使轉(zhuǎn)移性大腸癌患者的總生存期延長20.6～21.5個月。因此，化療的成敗將直接關系大腸癌患者的預后［8］。其療效取決于腫瘤對化療藥物的敏感程度，這由腫瘤自身的生物學特性決定。究其原因可能是由于腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。MDR指腫瘤細胞被一種藥物誘發(fā)耐藥后，同時對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象［9］。MDR是一個多基因參與、涉及多種基因產(chǎn)物的復雜過程。滿意的化療是指在獲得有效的治療效果的同時，藥物毒性更小。若能盡早預測大腸癌患者對化療藥物的耐藥，可增加醫(yī)療效費比，縮短患者化療時間，減少不良反應。

近年研究表明，miRNA在多種惡性腫瘤中表達對腫瘤具有診斷價值并參與腫瘤的進展［10-11］。本研究通過1 200個探針對大腸癌組織標本進行篩選，篩選同時對組織標本進行配對研究，以減少干擾因素。結(jié)果顯示，miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-939、miR-455-3p可能與大腸癌一線化療耐藥有關。通過對miR-4299和miR-196b進行ROC曲線的分析，miR-4299和miR-196b對化療耐藥有明顯診斷意義。miR-4299的AUC為0.784，而miR-196b的AUC為0.647。兩個聯(lián)合的AUC升高為0.848，敏感度和特異度分別為67.9%和90.9%，較單個miR敏感性和特異性有所提高，更有應用價值。Svoboda等［12］曾對20例新輔助放化療術(shù)后患者組織標本進行研究，通過microRNA芯片檢測，認為miR-196b有可能作為預測放化療標志物，但該文獻沒有表明能否單獨對耐藥患者進行預測，且研究標本較少。Popovic等［13］報道m(xù)iR-196b過表達對正常骨髓造血細胞增殖和生存有顯著影響。Tsaithe等［14］報道m(xù)iR-196b在胃癌組織中頻繁表達為低甲基化，有可能作為腫瘤標志物存在。

總之，miR-4299和miR-196b有可能作為診斷對大腸癌一線化療耐藥的標志物，尤其對術(shù)后化療有一定的指導意義。但需要更多大樣本的其他腫瘤數(shù)據(jù)加以證實和深入研究。

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The microRNA of advanced colorectal cancer predict efficacy of first-line chemotherapy

HU Jin-song, CAI San-jun (Department of Colorectal Cancer, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

CAI San-jun E-mail: caisanjun@gmail.com

Background and purpose: Colorectal cancer (CRC) is the most frequently occurring primary malignant tumor. Chemotherapy can reduce the risk of local and distant relapse. Therefore, it is very important to find new biomarkers that can predict chemoresistant and help in treatment decisions. Methods: In this study, we examined the expression levels of 1 200 human miRNAs in 6 CRC tissues, using miRNA profiling assay arrays. A validation study was done to corroborate a subset of the results, including expression levels of miR-4299, miR-196b, miR-324-5p, miR-455-3p and miR-939, by analyzing 100 specimens of stage Ⅳ colorectal adenocarcinoma (not respond and respond to the chemotherapy) to quantitative real-time PCR. We modeled the relationship between the expression levels of these miRNAs and the survival rate of 100 CRC patients by Kaplan-Meier method. Results: Expression profiles in CRCs suggested that 5 miRNAs were candidate markers associated with the chemoresistance of colorectal cancer. We found that miR-4299 and -196b had significant diagnostic value for chemoresistance CRC. miR-4299 yielded an AUC (the areas under the ROC curve) of 0.784 and miR-196b yielded an AUC of 0.647 in discriminating CRC from controls. Combined ROC analysis using these 2 miRNAs revealed an elevated AUC of 0.848 with 67.9% sensitivity and 90.9% specificity in discriminating chemoresistance CRC. The low level of miR-4299 expression and the high level of -196b expression are significantly correlated with the good survival of CRC patients. Conclusion: These data suggest that miR-4299 and -196b have strong potential as novel biomarkers for chemoresistant detection of colorectal cancer.

Colorectal cancer; Chemotherapy; Biomarkers; miR-4299; miR-196b

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.07.004

R735.3

：A

：1007-3639(2013)07-0499-06

2013-01-23

2013-05-25）

國家985Ⅲ期基金資助項目(No：YFX0102)。

蔡三軍 E-mail:caisanjun@gmail.com