Smad4靜默對(duì)K-ras突變小鼠胰腺PanIN細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響

齊曉光胡毅汪進(jìn)良談文龍王琪王立夫Tuveson DA

1.解放軍總醫(yī)院腫瘤綜合治療科二病區(qū)，北京 100853；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所，上海 200025；

3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200025；

4.英國劍橋大學(xué)腫瘤科，劍橋CB2 ORE

Smad4靜默對(duì)K-ras突變小鼠胰腺PanIN細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響

齊曉光1胡毅1汪進(jìn)良1談文龍2王琪3王立夫3Tuveson DA4

1.解放軍總醫(yī)院腫瘤綜合治療科二病區(qū)，北京 100853；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所，上海 200025；

3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200025；

4.英國劍橋大學(xué)腫瘤科，劍橋CB2 ORE

背景與目的：由己建立的小鼠基因打靶模型證實(shí)，K-ras突變啟動(dòng)了胰腺癌前病變—胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)，p53、p16失活均可單獨(dú)促進(jìn)小鼠PanIN發(fā)展為浸潤性胰腺癌。作為人胰腺癌中另一失活頻率高發(fā)的抑癌基因Smad4，本課題組前期研究提示，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默PanIN細(xì)胞株中內(nèi)源性Smad4表達(dá)，促使PanIN細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化?；诖四康模狙芯窟M(jìn)一步探討siRNA干擾Smad 4基因?qū)anIN細(xì)胞體內(nèi)外增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響，從而有助于闡明PanIN惡性轉(zhuǎn)化的新機(jī)制。方法：構(gòu)建和篩選能特異性靜默PanIN細(xì)胞中Smad4表達(dá)的最佳siRNA穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最佳siRNA表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入PanIN細(xì)胞，用Zeocin篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，挑選陽性克隆、擴(kuò)增，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞命名為PanIN-S。本研究運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)等分別比較兩組在活細(xì)胞率和體外增殖能力的影響，同時(shí)為進(jìn)一步驗(yàn)證Smad 4基因靜默對(duì)PanIN細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響，本研究采用Transwell和Mitigel assay檢測(cè)其干擾前后體外運(yùn)動(dòng)、侵襲能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立PanIN及PanIN-S細(xì)胞組裸鼠移植瘤模型，并應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)并比較兩組PCNA、VEGF和MMP-9的表達(dá)及其差異。結(jié)果：成功構(gòu)建了Smad4基因siRNA體系；體外實(shí)驗(yàn)中與PanIN組相比，PanIN-S組細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；動(dòng)物模型免疫組化結(jié)果顯示，與PanIN組相比，PanIN-S組PCNA、VEGF和MMP-9表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。結(jié)論：K-ras突變基礎(chǔ)上小鼠PanIN細(xì)胞Smad4基因靜默促使PanIN細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；PanIN基礎(chǔ)上Smad4靜默促使小鼠PanIN細(xì)胞體內(nèi)外增殖及轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，其增殖及轉(zhuǎn)移可能與PCNA、VEGF和MMP-9高表達(dá)有關(guān)。

siRNA干擾；Smad4基因；胰腺上皮肉瘤變細(xì)胞；細(xì)胞增殖；轉(zhuǎn)移

胰腺癌一旦診斷大約85%有局部和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后極差，基于此，胰腺癌的早期診斷一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問題之一，為此深入研究胰腺癌的癌前病變胰腺管內(nèi)上皮瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)的分子惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制［1］，可能是胰腺癌早期診斷并尋找有效治療方法的關(guān)鍵所在。PanIN是近幾年提出的新術(shù)語并被認(rèn)為是胰腺癌前病變之一［2］。

本課題組前期研究表明，PanIN細(xì)胞的致瘤性，但并未見肺臟、肝臟、胰腺等器官轉(zhuǎn)移，其病變類型類似于結(jié)腸腺瘤，組織病理學(xué)檢查證實(shí)為PanIN1-PanIN2［3］。進(jìn)一步研究采用siRNA干擾技術(shù)靜默Smad4基因的表達(dá)，證實(shí)PanIN基礎(chǔ)上的Smad4基因靜默能導(dǎo)致進(jìn)展期胰腺癌的發(fā)生，其病理結(jié)果符合胰腺導(dǎo)管腺癌［4-5］。然而，Smad4靜默后對(duì)PanIN細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制尚未闡明，故研究提示，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討Smad4基因靜默后其惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制，為胰腺癌的靶向治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

PanIN細(xì)胞由英國劍橋大學(xué)Tuveson D.A.教授惠贈(zèng)，其為 K-ras突變小鼠基因打靶胰腺PanIN模型并經(jīng)體外建系而來，在基因突變分析PanlN細(xì)胞中除可檢測(cè)到K-rasG12D突變外無p16、Tp53、Smad4突變或缺失，LoxP-Stop-LoxP-K-rasG12D的建立參照參考文獻(xiàn)［5］。

1.1.2 動(dòng)物

無特殊病原體(SPF)級(jí)BALB/c裸鼠10只，5周齡，雌雄不限，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 試劑

Smad4抗體(H-552，Santa Cruz，1∶500)，TRIzol試劑(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Takara公司)，LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)，PCNA抗體(Cell Signaling公司1∶2000)；VEGF抗體(Cell Signaling Technology，1∶100 )；MMP-9抗體(Santa Cruz，1∶50)，免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Smad4等引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成［4］。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長曲線

分別取對(duì)數(shù)生長期的PanIN、PanIN-S細(xì)胞，0.25%胰酶消化，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，并用計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，以繪制體外生長曲線，其具體方法如下：用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種至5個(gè)6孔板(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，每孔細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h計(jì)數(shù)1次，每組計(jì)數(shù)后取平均值。計(jì)數(shù)期間每3天換液1次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.2 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

分別取PanIN、PanIN-S細(xì)胞，接種于6孔板(細(xì)胞數(shù)均為5 000個(gè)/孔)，每個(gè)細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔對(duì)照，觀察干擾前后在半固體培養(yǎng)基中的生長情況。6孔板底層為0.6%瓊脂糖培養(yǎng)基，上層為0.3%瓊脂糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～20 d，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)＞50的克隆數(shù)，上述實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。細(xì)胞集落形成率=細(xì)胞集落數(shù)/接種的細(xì)胞總量×100%。

1.2.3 Transwell小室體外運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

0.25%胰酶消化各組PanIN細(xì)胞、PanIN-S細(xì)胞，計(jì)數(shù)并用無血清1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至濃度為1×106/mL。在Transwell小室(Chemicon公司)下室加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基500 μL，上室加入無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞懸液200 μL，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)48 h。棄上室液體，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面的未穿透的細(xì)胞，經(jīng)甲醇固定15 min，常規(guī)蘇木素染色，選擇5個(gè)高倍鏡(×200)視野，計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)(穿膜細(xì)胞數(shù))，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示其運(yùn)動(dòng)能力，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Matrigel基質(zhì)體外侵襲實(shí)驗(yàn)

0.25%胰酶消化各組PanIN細(xì)胞、PanIN-S細(xì)胞，計(jì)數(shù)并用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至濃度為1×106/mL。在含有Matrigel基質(zhì)的Transwell小室(Chemicon公司)下室加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基500 μL，上室加入無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞懸液200 μL，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)48 h。棄上室液體，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面的Matrigel基質(zhì)，經(jīng)甲醇固定15 min，常規(guī)蘇木素染色，選擇5個(gè)高倍鏡(×200)視野，計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)(穿膜細(xì)胞數(shù))，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示其侵襲能力，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 移植瘤中PCNA、VEGF和MMP-9表達(dá)檢測(cè)

小鼠PanIN及PanIN-S胰腺移植瘤的構(gòu)建及病理鑒定參照參考文獻(xiàn)［4］；兩組移植瘤分別石蠟包埋固定，石蠟切片脫蠟水化，3%過氧化氫室溫溫育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；微波抗原修復(fù)20 min，滴加正常山羊血清封閉液20 min，加入第一抗體4 ℃下過夜后洗片，加入第二抗體并在室溫下溫育30 min后洗片，加入ABC并在室溫下溫育30 min洗片，加入DAB試劑盒并行顯色反應(yīng)，脫水、封片(PCNA 1∶2 000；VEGF 1∶100；MMP-9 1∶50)；PCNA主要表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，VEGF和MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，其數(shù)據(jù)處理由我院圖像分析處理室專用軟件完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料除特別說明外，采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PanIN細(xì)胞干擾前后細(xì)胞生長能力的變化

隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，兩組細(xì)胞數(shù)目有不同程度的增加，但PanIN-S組細(xì)胞數(shù)目較PanIN組增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 PanIN細(xì)胞干擾前后細(xì)胞增殖能力的變化

在體外軟瓊脂克隆形成中，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，與PanIN組相比，PanIN-S組細(xì)胞活力及增殖增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.3 PanIN細(xì)胞干擾前后細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力的變化

與PanIN細(xì)胞組相比，PanIN-S細(xì)胞組細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖 1 兩組細(xì)胞生長能力比較Fig. 1 Comparison of the growth curve between PanIN and PanIN-S cells

2.4 PCNA、VEGF和MMP-9在PanIN及PanIN-S移植瘤中的表達(dá)

PCNA主要表達(dá)于增殖的腫瘤上皮細(xì)胞中，以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，結(jié)果顯示，PanIN-S組表達(dá)陽性率顯著高于PanIN組，分別為89.3%±10.1%、69.7%±8.5%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4-6)。

VEGF和MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果顯示，PanIN-S組表達(dá)陽性率顯著高于PanIN組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖 2 兩組間軟瓊脂克隆形成數(shù)目比較Fig. 2 Comparison of the cloning numbers of cells in soft agar in different groups

圖 3 Transwell和Matrigel體外運(yùn)動(dòng)、侵襲實(shí)驗(yàn)Fig. 3 Cell migration and invasive assay by transwell (×200)

圖 4 兩組移植瘤中PCNA表達(dá)Fig. 4 The expressions of PCNA in PanIN and PanIN-S groups (×400)

圖 5 兩組移植瘤中VEGF表達(dá)Fig. 5 The expressions of VEGF in PanIN and PanIN-S groups (×400)

圖 6 兩組移植瘤中MMP-9表達(dá)Fig. 6 The expressions of MMP-9 in PanIN and PanIN-S groups (×400)

3 討 論

由于PanIN是近幾年提出的新術(shù)語并被認(rèn)為是胰腺癌前病變，至今尚無他人分離和建立PanIN細(xì)胞株。以前獲得的有關(guān)Smad4在早期PanIN細(xì)胞中表達(dá)而在后期PanIN和胰腺癌中缺失的證據(jù)主要來源于對(duì)外科術(shù)后PanIN和胰腺癌的混合性組織以及胰腺癌細(xì)胞株的分析而不是來自對(duì)PanIN細(xì)胞的研究［4］。文獻(xiàn)報(bào)道，在PanIN及胰腺癌中Smad4基因突變率約50%，在其他腫瘤中Smad4基因的失活頻率通常＜10%，表明Smad4基因在PanIN及胰腺癌發(fā)生中是較特異的腫瘤抑制基因，深入研究其惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制具有重要意義［6］。抑癌基因Smad4是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵性中間傳導(dǎo)分子［7］，而TGF-β是一種具有多功能活性的細(xì)胞因子，在組織的發(fā)育、再生、修復(fù)中起重要作用，并與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)改變密切相關(guān)。正常情況下，TGF-β-Smad4 信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過阻斷細(xì)胞周期中的G1/S轉(zhuǎn)換和促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞生長。Smad4缺失將促進(jìn)上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)換、細(xì)胞失控性生長等生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

本研究采用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)以及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法證實(shí)，Smad4基因靜默可促進(jìn)PanIN細(xì)胞生長、增殖能力的增強(qiáng)，與Duda等［8］的研究結(jié)果一致。

Smad4參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，可以解釋其在PanIN惡性轉(zhuǎn)化中的作用，而Smad4作為TGF-β-Smad4信號(hào)傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子，是否影響PanIN細(xì)胞的其他生物學(xué)行為，將是我們下一步研究關(guān)注的內(nèi)容。本研究采用Transwell、侵襲實(shí)驗(yàn)及黏附實(shí)驗(yàn)，觀察Smad4干擾前后PanIN細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)、侵襲能力，與PanIN組相比，PanIN-S組細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與Han等［9］研究結(jié)果一致。

PCNA是一種酸性蛋白，僅在增生細(xì)胞中合成和表達(dá)，為DNA合成和復(fù)制所必需，在細(xì)胞增殖過程中起重要作用，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，PanIN-S組PCNA陽性表達(dá)率顯著高于未干擾PanIN組，提示Smad4基因沉默可顯著促進(jìn)PanIN細(xì)胞增殖，并可發(fā)展為進(jìn)展期胰腺導(dǎo)管腺癌，與體外研究結(jié)果一致。

腫瘤的發(fā)生，不僅涉及細(xì)胞增殖，其與血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)改變等亦密切相關(guān)；VEGF是體內(nèi)一種強(qiáng)效力的促血管生成因子，能直接或間接參與血管生成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中具有極其重要的地位。本研究采用免疫組化技術(shù)標(biāo)記PanIN及PanIN-S移植瘤組織，結(jié)果顯示，PanIN組VEGF陽性表達(dá)率較低，而PanIN-S組，其表達(dá)明顯增加，提示VEGF可能與其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的重要一員，主要功能是降解Ⅳ型膠原，而Ⅳ型膠原又是基底膜的主要成分，而基底膜的降解既是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，同時(shí)又是腫瘤血管形成的重要環(huán)節(jié)，本研究結(jié)果顯示，PanIN-S組表達(dá)陽性率顯著高于PanIN組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示Smad4靜默小鼠轉(zhuǎn)移性胰腺癌模型中，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能與MMP-9高表達(dá)有密切關(guān)系。以上研究均與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，本研究證實(shí)K-ras突變基礎(chǔ)上小鼠PanIN細(xì)胞Smad4基因靜默增強(qiáng)PanIN細(xì)胞增殖、侵襲能力；其增殖及轉(zhuǎn)移可能與PCNA、VEGF和MMP-9高表達(dá)有關(guān)，有望為胰腺癌的靶向治療提供新的思路，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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Smad4 silencing on PanIN cells accelerates K-ras G12D-mediated pancreatic neoplasia

QI Xiaoguang1, HU Yi1, WANG Jin-liang1, TAN Wen-long2, WANG Qi3, WANG Li-fu3, TUVESON DA4(1. Department of Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine Shanghai 200025, China; 3. Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200025, China; 4. Cambridge Research Institute, Cancer Research UK, Cambridge CB2 ORE, UK)

WANG Li-fu E-mail: lifuwang2010@yahoo.cn

Background and purpose: Pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) may be a precursor lesion of infiltrating pancreatic ductal adenocarcinoma. The mutation of the phenotypic impact of K-ras G12D alone, silencing of p53 and p16 could promote this process. The role of Smad4 in this progression was poorly understood. In our previous studies, we investigated that RNA interference silence of Smad4 to promote the PanIN cell malignant transformation. In the present study, we investigate. The further explores the siRNA interference of Smad4 expression on PanIN cells could lead to proliferation and metastasis in vitro and in vivo. Methods: Smad4 knock-down PanIN cells (PanIN-S) were established by stable transfection with lentiviral-mediated Smad4 RNA interference. In vitro,silence of Smad4 enhanced the proliferation of PanIN cells as determined by cell counting. A soft agar assay was used to assess the anchorage-independent growth ability of cells. Cell migration and invasion assays were performed using transwell chambers with or without Matrigel. In xenograft model experiments, PCNA, VEGF and MMP-9 staining was separately used to evaluate cell proliferation and angiogenesis and migration (VEGF and MMP-9). Results: Effect of siRNA of Smad4 gene in PanIN cells was confirmed by real-time RT-PCR and western blot. In vitro, silence of Smad4 enhanced the proliferation of PanIN cells as determined by cell counting. Soft agar assay showed that there were more colony cell numbers in PanIN-S cells compared with PanIN cells (P＜0.05). Using the transwell assay, we observed that PanIN-S cells migrated faster than PanIN cells and similar results were obtained by Matrigel assay (P＜0.05). Furthermore, immunohistochemical analysis of the harvested tumors suggested that Smad4 silencing was associated with cell proliferation (PCNA reactivity) and angiogenesis and migration (VEGF and MMP-9), and the expressions of PCNA, VEGF and MMP-9 in PanIN-S group were significantly increased (P＜0.05). Conclusion: Silence of Smad4 in PanIN cells enhanced progression to invasive adenocarcinoma of the pancreas by promoting cell growth, migration and invasion. Smad4 might be a new diagnostic marker in pancreatic cancer and prove to be a feasible and novel target for therapeutic intervention.

siRNA interference; Smad4 gene; PanIN cell; Proliferation; Migration

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.07.001

R735.9

：A

：1007-3639(2013)07-0481-06

2013-03-22

2013-05-18）

國家自然科學(xué)基金(No：30672385)。

王立夫 E-mail:lifuwang2010@yahoo.cn