CBX7在胃癌干細胞樣細胞中的表達及其功能研究

趙麗琴郭偉劍張曉偉屈曉飛王小鳳倪蘇婕黃明主

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430022

CBX7在胃癌干細胞樣細胞中的表達及其功能研究

趙麗琴1郭偉劍1張曉偉1屈曉飛2王小鳳1倪蘇婕1黃明主1

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢 430022

背景與目的：色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7，CBX7)是一種參與調控細胞增殖衰老的轉錄抑制因子，屬于PcG家族成員，其在維持胚胎干細胞自我更新和全能性中發(fā)揮重要作用，但CBX7在腫瘤干細胞中的表達和作用鮮見報道。本研究旨在探討CBX7在胃癌干細胞樣細胞中的表達及其對胃癌干細胞相關特性的調節(jié)作用。方法：采用無血清懸浮培養(yǎng)法從MKN28胃癌細胞系中分離干細胞樣亞群，蛋白質印跡法(Western blot)檢測干細胞相關因子Oct4、β-catenin和CBX7蛋白表達。脂質體法將CBX7干擾質粒(CBX7i)和對照質粒(Ctrli)分別轉染入MKN28胃癌細胞，轉染后熒光顯微鏡觀察轉染效率，Western blot檢測CBX7下調效果，無血清懸浮培養(yǎng)檢測細胞自我更新能力，平板克隆檢測細胞克隆增殖能力改變。結果：無血清培養(yǎng)MKN28細胞，極少數(shù)細胞能形成干細胞樣懸浮球，其高表達Oct4、β-catenin兩個干細胞相關因子，且明顯高表達PcG家族蛋白CBX7?；蜣D染下調CBX7表達后，胃癌細胞無血清培養(yǎng)成球率降低，克隆形成率下降。結論：CBX7在胃癌干細胞樣細胞中高表達，其在調控胃癌干細胞自我更新和增殖能力中發(fā)揮重要作用。

色素框同源蛋白7；胃癌干細胞；自我更新；細胞增殖

［Key words］ CBX7; Gastric cancer stem cells; Self-renewal; Cell proliferation

腫瘤干細胞(cancer stem cells)是腫瘤中一小部分具有干細胞性質的細胞群體，具有自我更新、無限增殖能力和不定向分化潛能，是形成不同分化程度腫瘤細胞和腫瘤不斷擴展的源泉。目前，國內外學者已從白血病及乳腺癌等多種實體腫瘤中分離鑒定了腫瘤干細胞［1-2］。胃癌干細胞的研究起步不久，研究者們已初步從胃癌細胞系或胃癌組織中分離出胃癌干細胞或干細胞樣亞群［3-4］。色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7，CBX7)是一種參與調控細胞增殖衰老的轉錄抑制因子，其與Bmi-1、EZH2等同屬于PcG家族成員。已有研究報道CBX7在維持胚胎干細胞(embrynic stem cell，ESC)的自我更新及全能性、抑制ESC的分化中發(fā)揮重要作用［5］，但CBX7在腫瘤干細胞中的表達及其對腫瘤干細胞特性的調節(jié)作用鮮見報道。本研究旨在探討CBX7在胃癌干細胞樣細胞中的表達及其對胃癌干細胞相關特性的調節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗所用人胃癌細胞系MKN28由上海消化外科研究所保種；胎牛血清FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和低黏附性細胞培養(yǎng)板購于美國Hyclone公司，人表皮細胞生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、B27、脂質體LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；帶有綠色熒光標記的CBX7干擾質粒pGCL-GFP-CBX7i及對照質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司設計并構建；質粒抽提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；細胞蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于美國Promega公司；一抗：Oct4、CBX7、β-actin抗體為英國Abcam公司產品，β-catenin為美國Santa Cruz公司產品；二抗：Rabbit IgG-HRP為美國KPL公司產品，Mouse IgG-HRP為美國Santa Cruz公司產品。ECL發(fā)光液購于中國江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞系MKN28在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%條件下培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.2.2 無血清懸浮培養(yǎng)

本實驗采用無血清懸浮培養(yǎng)法分離胃癌干細胞樣亞群。選取MKN28胃癌細胞系對數(shù)生長期細胞，胰酶消化并吹打成單細胞懸液，用1×PBS洗滌2次，配制含EGF(20 ng/mL)、bFGF(10 ng/mL)、B27(1∶50)等生長因子的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基重懸洗滌后的MKN28細胞，計數(shù)后培養(yǎng)于低黏附性細胞培養(yǎng)板中，6孔板每孔中加入約5萬個細胞，加入無血清培養(yǎng)液2 mL，每4天換液1次。

1.2.3 蛋白質印跡法(Western blot)檢測

將無血清培養(yǎng)1周后形成的懸浮球收集到15 mL離心管中，靜置15 min，棄上清液以去除死亡的細胞，1×PBS洗滌2次，按細胞蛋白裂解液說明書操作，提取懸浮球細胞蛋白。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的MKN28貼壁胃癌細胞，選取對數(shù)生長期細胞，1×PBS洗滌2次，按細胞蛋白裂解液說明書操作提取細胞蛋白。BCA法測定懸浮球細胞和貼壁細胞蛋白濃度。按每通道50 μg蛋白上樣，5%濃縮膠80 V，10%分離膠120 V，電泳分離約150 min，經150 mA 120 min濕轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入一抗Oct4(1∶1 000)、β-catenin(1∶500)、CBX7(1∶1 000)、內參β-actin(1∶2 000)，分別4 ℃溫育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；HRP偶聯(lián)的二抗(1∶3 000)室溫溫育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；后用ECL發(fā)光液顯影，曝光。

1.2.4 CBX7i和Ctrli質粒轉染MKN28胃癌細胞與篩選

將處于對數(shù)生長期的MKN28細胞鋪到6孔板，每孔35萬個細胞，第2天用脂質體LipofectamineTM2000轉染，設置CBX7干擾質粒(CBX7i)和空載體對照質粒(Ctrli)轉染組?；蜣D染步驟參照LipofectamineTM2000說明書進行，轉染后6 h換液。24 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，以判斷轉染效率；用400 μg/ mL濃度G418篩選3 d后提取蛋白，Western blot檢測目的蛋白CBX7下調效果。

1.2.5 無血清懸浮培養(yǎng)成球實驗

本實驗中通過檢測無血清培養(yǎng)成球率來判斷細胞自我更新能力改變。將轉染并篩選后的MKN28胃癌細胞按1 000個/孔接種到低黏附性96孔板中，進行無血清懸浮培養(yǎng)，CBX7i組和Ctrli組各設10復孔。培養(yǎng)1周后，計數(shù)每個孔懸浮球數(shù)目，計算兩組平均懸浮球形成率。懸浮球形成率=懸浮球數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.6 平板克隆實驗

將轉染并篩選后的MKN28細胞按2 000個/孔接種到6 cm細胞培養(yǎng)皿中，CBX7i組和Ctrli組各設3復孔，每個培養(yǎng)皿加入完全培養(yǎng)基4 mL，5 d換液1次。培養(yǎng)2周后，吸除培養(yǎng)基，用1×PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌2次，結晶紫染色15 min，雙蒸水緩慢沖洗至克隆清晰可見，拍照進行克隆計數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據以x±s 表示，采用總體均數(shù)的假設檢驗(t檢驗)比較兩組懸浮球形成率和克隆形成率的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 無血清培養(yǎng)形成干細胞樣懸浮球

MKN28胃癌細胞在無血清、低黏附培養(yǎng)條件下，3 d后絕大部分細胞死亡，極少數(shù)細胞能形成懸浮球體，隨培養(yǎng)時間延長，球體逐漸增大，其內部細胞排列致密，不能分辨細胞輪廓(圖1)。

2.2 Oct4、β-catenin和CBX7表達情況

Western blot檢測結果顯示，懸浮球細胞較普通貼壁細胞高表達干細胞相關因子Oct4和β-catenin，同時明顯高表達PcG家族蛋白CBX7(圖2)。

圖 1 MKN28細胞無血清培養(yǎng)形成干細胞樣懸浮球Fig. 1 MKN28 cells can initiate stem-like floating spheres in serum-free culture

圖 2 貼壁細胞和懸浮球中Oct4、β-catenin和CBX7表達的差異Fig. 2 Different expression level of Oct4, β-catenin and CBX7 in adherent cells and floating spheres

2.3 轉染后轉染效率觀察及CBX7蛋白檢測

對照Ctrli組和CBX7i質粒組轉染24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察兩組細胞中綠色熒光，轉染效率均在80%以上。Western blot檢測CBX7表達，CBX7i組較Ctrli組CBX7表達明顯降低(圖3)。

2.4 CBX7干擾后細胞懸浮成球率

CBX7干擾后，轉染CBX7i質粒組10復孔平均懸浮球形成率為(1.97±0.47)%，而轉染對照Ctrli質粒組為(3.9±0.66)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖4)。

2.5 CBX7干擾后細胞克隆形成率

CBX7干擾后，轉染CBX7i質粒組平均細胞克隆形成率為(3.92±0.35)%；而對照Ctrli組為(8.72±0.95)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖5)。

圖 3 轉染后熒光顯微鏡觀察及CBX7蛋白檢測Fig. 3 Observation of transfection efficiency under fluorescence microscope and detection of CBX7 expression level by Western blot

圖 4 CBX7干擾后細胞懸浮成球率檢測Fig. 4 Detection of sphere-forming efficiency after downregulation of CBX7

圖 5 CBX7干擾后細胞克隆形成率檢測Fig. 5 Detection of colony-forming efficiency after downregulation of CBX7

3 討 論

腫瘤干細胞雖僅占腫瘤細胞的極少部分，但由于其具有不斷的自我更新能力、對放化療等治療的抵抗和高轉移等特性，而成為腫瘤治療失敗、日后復發(fā)轉移的根源［6-8］。腫瘤干細胞研究已成為目前的研究熱點與今后的重要發(fā)展方向之一?，F(xiàn)在已有越來越多的證據顯示腫瘤干細胞的存在［1-2,9-10］，但干細胞特性的調控機制仍了解有限。如能闡明腫瘤干細胞的調控機制，可能帶來腫瘤治療療效的突破。

干細胞的分離方法有無血清懸浮培養(yǎng)法、表面標記物免疫磁珠或流式細胞儀分選、側群(SP)細胞分選等，其中無血清懸浮培養(yǎng)法同時具有分離干細胞與鑒定干細胞特性的雙重作用，觀察在無血清培養(yǎng)條件下形成懸浮球可以檢測干細胞自我更新能力。雖然目前研究者們已初步分離了胃癌干細胞，但是胃癌干細胞的表面標志物尚存在爭議。CD44、CD24、CD133等是胃癌干細胞可能的表面標志分子［11-13］。

PcG家族基因為外源性基因沉默因子，在維持干細胞特性、早期胚胎發(fā)育、調控細胞衰老與凋亡以及腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。PcG蛋白通常組成Polycomb 抑制型復合物(polycomb repressive complex，PRC)來發(fā)揮作用，如PRC1 和PRC2。已有研究報道，PcG家族成員Bmi-1、EZH2在調節(jié)干細胞和(或)腫瘤干細胞特性中發(fā)揮重要作用［14-16］。CBX7屬于PcG家族成員，是一種參與調控細胞增殖衰老的轉錄抑制因子，為PRC1的成員之一［17］。研究表明，CBX7 mRNA在人的大腦、心臟、腎和骨骼肌中高表達，可參與維持多種正常細胞的生長，并能使小鼠成纖維細胞永生化［18］。在分子水平，CBX7可不依賴于Bmi-1抑制INK4a/ ARF基因座［18］，與Bmi-1的部分功能、機制作用相似。最近研究發(fā)現(xiàn)，CBX7在維持ESC的自我更新與全能性、抑制ESC的分化中發(fā)揮重要作用［5］。我們以往的研究已證實，CBX7在調控胃癌細胞衰老、遷移等過程中發(fā)揮作用，其機制可能是通過抑制p16表達［19］。

如何將腫瘤干細胞分離出來進行培養(yǎng)，并保持其未分化狀態(tài)，是進行腫瘤干細胞研究的前提。Singh等［20］利用添加生長因子的無血清培養(yǎng)基從膠質瘤、髓母細胞瘤中分離和培養(yǎng)出腦腫瘤干細胞，在腫瘤干細胞的分離培養(yǎng)方面取得了突破性進展。本研究通過無血清懸浮培養(yǎng)分離胃癌干細胞樣亞群，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)懸浮球中干細胞相關因子Oct4和β-catenin高表達，進一步說明分離得到的是干細胞樣亞群。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在干細胞樣亞群中PcG蛋白CBX7明顯高表達，提示CBX7在調節(jié)胃癌干細胞特性中可能發(fā)揮重要作用。在CBX7調節(jié)干細胞相關特性的研究中，首先采用基因轉染的方法，下調胃癌細胞中CBX7表達水平，進而觀察CBX7表達下調后無血清懸浮培養(yǎng)成球率的變化以及克隆形成率的變化。從實驗結果可以看出，CBX7表達下調后無血清懸浮培養(yǎng)成球率明顯降低，克隆形成率下降。

綜上所述，CBX7在胃癌干細胞樣細胞中呈明顯高表達，其在調控胃癌干細胞自我更新和增殖中發(fā)揮重要作用，有望成為針對胃癌干細胞治療胃癌的一個靶點。但是，CBX7調控胃癌干細胞特性的具體機制和作用靶點有待進一步研究。

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《抗癌》雜志征稿啟事

《抗癌》雜志于1988年創(chuàng)刊，主管單位為上海市科學技術協(xié)會，主辦單位為上海市抗癌協(xié)會，雜志刊號：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。征稿欄目及內容如下。

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二、《正誼明道、大醫(yī)精誠》欄目

真實記錄醫(yī)生對患者的關懷；或是愛崗敬業(yè)、精益求精富有專業(yè)精神的事跡，能讓更多醫(yī)道同仁敬重和學習?？梢灾v述患者眼里的醫(yī)生，也可以記錄你的同事。

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The expression and function of CBX7 in gastric cancer stem-like cells

ZHAO Li-qin1, GUO Wei-jian1, ZHANG Xiao-wei1, QU Xiao-fei2, WANG Xiao-feng1, NI Su-jie1, HUANG Ming-zhu1(1. Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China. 2. Center of Oncology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei 430022, China)

Correspondence to: GUO Wei-jian E-mail: guoweijian1@sohu.com
［Abstract］ Background and purpose：Chromobox protein homolog 7(CBX7) is a PcG family protein that regulates cell proliferation and senescence acting as a transcriptional repressor. It plays an important role in maintaining self-renewal and totipotency of embryonic stem cells. However, the expression and function of CBX7 in cancer stem cells haven’t been reported. This study aimed to investigate the expression of CBX7 in gastric cancer stem-like cells and its function in regulating gastric cancer stem cells’ properties. Methods：Gastric cancer stem-like cells were seperated from gastric cancer cell line MKN28 via serum-free culture. The expression of stem cell related factors(Oct4, β-catenin) and CBX7 were assayed by Western blot. CBX7 interfering plasmid (CBX7i) and its control plasmid (Ctrli) were respectively tranfected into MKN28 cells using LipofectamineTM2000. After transfection, a fluorescence microscope was used to observe transfection efficiency, and CBX7 expression level was determined by Western blot. The ability of selfrenewal was assayed by serum-free culture, and anchorage independent growth was analyzed using colony formation assay. Results：A very small number of MKN28 cells could initiate stem-like floating spheres. Cells in these spheres expressed higher level of Oct4, β-catenin and CBX7 than adherent cells. After the downregulation of CBX7 by gene transfection in MKN28 cells, both the sphere-forming efficiency and the capability of clonogenecity were decreased. Conclusion：CBX7 is highly expressed in gastric cancer stem-like cells. It plays important roles in regulating selfrenewal and proliferation of gastric cancer stem cells.

R735.2

：A

：1007-3639(2013)02-0114-06?

2012-09-13

2012-11-20）

國家自然科學基金(No:81041074)。

郭偉劍 E-mail:guoweijian1@sohu.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.006