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    靶向沉默HOXA9基因?qū)937細胞體內(nèi)外增殖的影響

    2013-06-07 11:20:27
    中國癌癥雜志 2013年2期
    關(guān)鍵詞:生存期空白對照白血病

    濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,山東 濱州 256603

    靶向沉默HOXA9基因?qū)937細胞體內(nèi)外增殖的影響

    賈秀紅 張艷君 李建廠

    濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,山東 濱州 256603

    背景與目的:多數(shù)急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)患者高表達同源盒A9(homeoboxA9,HOXA9),而HOXA9高表達與患者預(yù)后差有關(guān)。本研究探討慢病毒載體介導(dǎo)shRNA(short harpin RNA,siRNA前體)靶向沉默HOXA9基因?qū)θ思毙詥魏税籽〖毎闡937細胞在體內(nèi)外增殖的影響。方法:將U937細胞分為干擾組、陰性對照組、空白對照組,轉(zhuǎn)染效率>90%時,經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定對HOXA9基因的沉默作用;FCM檢測各組細胞周期的變化;繪制各組細胞生長曲線。將32只裸鼠腹腔接種U937細胞,隨機分為4組,即陰性對照組、干擾組、陰性對照聯(lián)合VCR組、干擾聯(lián)合VCR組,每組8只,每只裸鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg,連續(xù)4 d。1周后向陰性對照聯(lián)合VCR組和干擾聯(lián)合VCR組裸鼠的腹腔注射VCR 0.5 mg/kg,每周1次,連續(xù)4周。觀察各組裸鼠的生存期。結(jié)果:流式細胞儀測得慢病毒對U937細胞的轉(zhuǎn)染效率>90%,干擾組HOXA9的蛋白表達水平為46.56%±3.54%,較空白對照組和陰性對照組均下降(P<0.05)。干擾組細胞被阻滯于G0/G1期,其增殖明顯受到抑制。慢病毒干擾HOXA9基因的表達聯(lián)合VCR可顯著延長裸鼠的生存期。結(jié)論:以慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靶向沉默HOXA9基因表達,可明顯抑制U937細胞在裸鼠體內(nèi)外的增殖。

    同源盒A9;RNA干擾;U937細胞;白血病

    同源盒A9(homeoboxA9,HOXA9)基因位于人類7號染色體短臂(7p15-p14),其編碼的轉(zhuǎn)錄因子對調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細胞分化和機體造血起著至關(guān)重要的作用。80%的急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)患者高表達同源盒A9(homebox A9,HOXA9)基因,且高表達HOXA9基因的患者預(yù)后較差[1]。U937細胞內(nèi)t(10;11)(p13;q14)基因突變使AF10基因與CALM基因融合[2],產(chǎn)生白血病的癌基因CALMAF10,有研究表明HOXA9基因與癌基因CALMAF10有關(guān),CALM-AF10陽性的T淋巴母細胞淋巴瘤患者往往有HOXA9的表達[3]。高表達CALM-AF10基因的白血病小鼠造血組織內(nèi)HOXA9基因的表達水平較高,提示HOXA9基因可能是CALM-AF10基因的下游靶基因[4]。目前,HOXA9基因在CALM-AF10基因相關(guān)白血病中的作用尚不明確。本研究探討慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靶向沉默HOXA9基因?qū)937細胞在裸鼠體內(nèi)外增殖的影響。

    1 材料和方法

    1.1 細胞株和試劑

    靶向沉默HOXA9基因的慢病毒載體(本課題組前期實驗構(gòu)建成功,針對HOXA9基因的siRNA序列為3’-AAGGAGTTTCTGTTCAATATG-5’,本實驗所用慢病毒為3質(zhì)粒系統(tǒng)包裝而成,即干擾質(zhì)粒pGC-shHOXA9-GFP-LV、輔助質(zhì)粒pHelper 1.0及pHelper 2.0),陰性對照慢病毒(pGC-GFP-lentivirus)購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司;人髓性白血病細胞株U937購自中國科學(xué)院細胞庫;兔抗人HOXA9多克隆抗體、二甲基亞砜(DMSO)和聚凝胺購自美國Sigma公司,兔抗人α-tubulin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗為聯(lián)科生物進口分裝;RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;GIBCO胎牛血清購自美國Invitrogen公司;MTT粉為美國Amresco公司進口分裝;核蛋白和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

    1.2 實驗動物

    4~6周齡裸鼠(BALB/cA-nu)購于北京華阜康生物科技股份有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2009-0007],雌性,體質(zhì)量15~18 g,飼養(yǎng)于SPF級動物房,符合倫理委員會認可標準。

    1.3 細胞分組及處理

    將U937細胞置于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d傳代1次,細胞生長狀態(tài)良好,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。取對數(shù)生長期的U937細胞均勻接種在24孔板中,每孔細胞數(shù)約為1.5×105,分為3組:空白對照組、陰性對照組、干擾組。每組均加入終濃度為8 μg/mL的聚凝胺,分別在干擾組、陰性對照組細胞中加入干擾慢病毒和陰性對照慢病毒(MOI=10),空白對照組加等量磷酸鹽緩沖液(PBS),培養(yǎng)24 h后更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),慢病毒轉(zhuǎn)染5 d后進行以下相關(guān)檢測。

    1.3.1 流式細胞術(shù)檢測慢病毒對白血病細胞的轉(zhuǎn)染效率

    在熒光顯微鏡下觀察空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞GFP表達情況并照相,收集3組細胞,PBS洗滌2次,30 min內(nèi)用流式細胞儀測定GFP陽性細胞率,轉(zhuǎn)染效率達到80%以上時進行后續(xù)實驗。

    1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測HOXA9蛋白的表達

    慢病毒轉(zhuǎn)染5 d后收集空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞,用冷PBS洗滌2次,根據(jù)細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白提取試劑盒說明書,依次加入bufferA、bufferB、bufferC,裂解細胞膜和細胞核,16 000×g離心10 min,收集上清液即得細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白并混勻,取少量用BCA法測蛋白濃度,其余加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5 min,-80 ℃保存。取等量蛋白,SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h,經(jīng)1×TBST充分漂洗(10 min×3次),加兔抗人HOXA9多克隆抗體(稀釋度為1/300),4 ℃溫育過夜,充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋度為1/2 400),室溫溫育1 h,充分漂洗后化學(xué)發(fā)光法顯色。用α-tublin做內(nèi)參重復(fù)以上步驟。采用Gel-Pro analyzer軟件分析圖像,以HOXA9/ α-tubulin比值表示目的基因蛋白的相對表達水平。

    1.3.3 細胞生長曲線

    分別于慢病毒轉(zhuǎn)染U937細胞0、3、5、7 d后計數(shù)空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞數(shù)量,每組細胞計數(shù)3次取均值,本實驗獨立重復(fù)3次。

    1.3.4 細胞周期檢測

    慢病毒轉(zhuǎn)染U937細胞5 d后,分別收集空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞,每管3 mL (約含4×106個細胞) ,PBS洗滌3次,離心,棄上清液,每組細胞沉淀加入70%冰乙醇1 mL并重懸,4 ℃固定過夜,離心棄乙醇,PBS洗滌并重懸,加入RNaseA(終濃度為50 mg/L),37 ℃水中溫浴40 min,加入碘化丙啶(PI)50 μL,混勻,4 ℃避光放置60 min,尼龍網(wǎng)過濾,流式細胞儀檢測。每組樣本獨立重復(fù)3次。

    1.4 建立AML裸鼠移植瘤模型

    將32只裸鼠隨機分為4組:陰性對照組、干擾組、陰性對照聯(lián)合VCR組、干擾聯(lián)合VCR組,每組8只,每只裸鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg,連續(xù)4 d[5]。第5天分別取陰性對照組和干擾組U937細胞,經(jīng)熒光激活細胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,F(xiàn)ACS)分選出帶有綠色熒光的細胞,PBS洗滌2次并重懸,調(diào)整細胞密度為2.5×107/mL,取200 μL細胞懸浮液(約5×106個細胞)接種到裸鼠腹腔,1周后向陰性對照聯(lián)合VCR組和干擾聯(lián)合VCR組裸鼠的腹腔注射VCR 0.5 mg/kg,每周1次,連續(xù)4周[6]。每2 d稱裸鼠體質(zhì)量,觀察裸鼠生存期。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

    數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析,數(shù)據(jù)均以x±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析,多個均數(shù)間兩兩比較采用LSD(方差齊)或Tamhane檢驗(方差不齊);生存期比較用Logrank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 慢病毒對U937細胞轉(zhuǎn)染效率

    慢病毒轉(zhuǎn)染U937細胞(MOI=10)5 d后GFP陽性細胞率約為90%,倒置熒光顯微鏡下可見GFP陽性細胞滿視野,可滿足實驗要求(圖1)。

    2.2 慢病毒對HOXA9基因的敲減效率

    Western blot實驗結(jié)果顯示,干擾組HOXA9蛋白表達水平為46.56%±3.54%,較陰性對照組、空白對照組顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.01,P=0.000),陰性對照組和空白對照組之間HOXA9蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000,圖2)。

    圖 1 慢病毒感染5 d后的U937細胞Fig. 1 U937 cells 5 days after lentivirus transfection (×200)

    圖 2 Western Blot法檢測各組HOXA9 蛋白表達水平Fig. 2 HOXA9 protein expression level detected by Western blot

    2.3 細胞生長曲線

    慢病毒轉(zhuǎn)染U937細胞3 d后,干擾組細胞增殖速度變慢,細胞數(shù)量少于空白對照組和陰性對照組,轉(zhuǎn)染7 d后,干擾組細胞數(shù)量較空白對照組和陰性對照組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.005,P=0.000),空白對照組和陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.307,圖3)。

    圖 3 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞周期分布Fig. 3 Cell growth curve of each group after lentivirus transfection

    2.4 FCM檢測細胞周期

    干擾組U937細胞處于G0/G1期的細胞百分比高于陰性對照組和空白對照組,而S期和G2/M期的細胞百分比明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(G0/G1期:F=65.55,P=0.000;S期:F=9.003,P=0.016;G2/M期:F=35.91,P=0.000),陰性對照組和空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這表明運用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HOXA9基因在U937細胞內(nèi)的表達水平能阻止細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變過程,細胞周期停滯于G0/G1期,G2/M期的細胞比例降低,減少DNA合成,抑制細胞增殖(表1,圖4)。

    2.5 裸鼠生存期

    腹腔接種U937細胞3周后,陰性對照組及干擾組裸鼠均出現(xiàn)腹水,陰性對照組腹水較干擾組嚴重,兩組體質(zhì)量下降均不明顯,陰性對照組和干擾組裸鼠生存期分別為(18.63±3.25)d和(26.25±3.91)d,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.68,P=0.000)。提示下調(diào)HOXA9的表達水平可抑制U937細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖,延長裸鼠的生存期。陰性對照聯(lián)合VCR組和干擾聯(lián)合VCR組的腹水不明顯,生存期分別為(36.00±3.38)d和(40.63±6.86)d,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.43,P=0.035),說明干擾組的化療效果好于陰性對照組,HOXA9基因的表達水平降低可增強U937細胞對化療藥物的敏感性(圖5)。

    表 1 慢病毒轉(zhuǎn)染5 d后3組細胞周期分布Tab. 1 Cell cycle distribution of 3 groups 5 days after lentivirus transfection

    圖 4 慢病毒轉(zhuǎn)染5 d后各組細胞周期分布Fig. 4 Cell cycle distribution of three groups five days after lentivirus transfection

    圖 5 各組裸鼠生存曲線Fig. 5 Survival curves of nude mice

    3 討 論

    白血病的發(fā)病機制與基因異常密切相關(guān)。急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和AML患者體內(nèi)均存在CALM-AF10基因[2,7-9],然而僅有CALM-AF10基因高表達的白血病的發(fā)病周期較長,且癥狀不典型。混合譜系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)基因是急性兒童白血病和治療相關(guān)白血病的常見突變基因,存在MLL基因的患者預(yù)后不佳,F(xiàn)aber等[10]研究發(fā)現(xiàn)沉默HOXA9基因的表達,MLL基因陽性細胞在小鼠體內(nèi)外的增殖受到抑制。BCR-ABL融合基因是慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的典型基因突變,對CML的進展起促進作用,Tedeschi等[11]研究發(fā)現(xiàn)在CML患者體內(nèi)均有HOXA9基因和BCR-ABL共同表達,提示HOXA9基因與BCR-ABL基因可能存在調(diào)節(jié)與被調(diào)節(jié)的關(guān)系,HOXA9基因?qū)CR-ABL基因?qū)е碌腃ML起協(xié)同作用。HOXA9基因可與其他基因發(fā)生融合,如NUP98-HOXA9基因可使斑馬魚發(fā)生骨髓增生性腫瘤[12]。以上提示HOXA9基因可通過與其他突變基因聯(lián)合或自身發(fā)生突變促進白血病的發(fā)生,在白血病的發(fā)病機制中起了較為重要的作用。運用RNA干擾技術(shù)干擾HOXA9的表達可能會在白血病的治療上取得突破性的進展。

    本研究以慢病毒作為shRNA的表達載體,在體外干擾HOXA9基因的表達,發(fā)現(xiàn)U937細胞正常增殖周期受到影響,大部分細胞被阻滯于G0/G1期,DNA合成減少、有絲分裂減慢;細胞生長曲線可以明顯看出干擾組U937細胞增殖速度慢于空白對照組和陰性對照組,下調(diào)HOXA9基因的表達水平使U937細胞體外的增殖受到抑制。Orlovsky等[13]沉默RS4;11細胞(前B細胞白血病細胞株)HOXA9基因后,RS4;11細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變過程受阻,與陰性對照組細胞相比,G0/G1期細胞增加,S期細胞減少,細胞增殖同樣受到抑制,與本研究結(jié)果一致。HOXA9基因參與細胞周期調(diào)控的具體機制尚不明確,有待進一步研究。

    動物體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,干擾組較陰性對照組的生存期延長,在聯(lián)合VCR的情況下干擾組較陰性對照組的生存期也得到延長,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示化療前后運用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HOXA9基因的表達水平均可延長小鼠的生存期,干擾聯(lián)合VCR組小鼠的生存期最長,效果最好,下調(diào)HOXA9基因的表達水平有助于增強U937細胞對VCR的敏感性。Faber等[10]發(fā)現(xiàn)沉默HOXA9基因后,白血病細胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的增殖受到抑制,數(shù)量明顯少于對照組,與本研究觀察的時間點不同,但結(jié)果較一致,即沉默HOXA9基因可抑制白血病細胞在小鼠體內(nèi)的增殖。

    總之,HOXA9基因在白血病的發(fā)病機制中發(fā)揮一定的作用,下調(diào)HOXA9基因的表達水平后,U937細胞在小鼠體內(nèi)外的增殖明顯受到抑制,亦可增強白血病細胞對化療藥物的敏感性,為CALM-AF10和MLL基因突變的白血病患者提供更加有效的治療措施。

    [1] GOLUB T R, SLONIM D K, TAMAYO P, et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring[J]. Science, 1999, 286(5439): 531-537.

    [2] DREYLING M H, MARTINEZ-CLIMENT J A, ZHENG M, et al. The t(10;11)(p13;q14) in the U937 cell line results in the fusion of the AF10 gene and CALM, encoding a new member of the AP-3 clathrin assembly protein family[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(10): 4804-4809.

    [3] BALEYDIER F, DECOUVELAERE A V, BERGERON J, et al. T cell receptor genotyping and HOXA/TLX1 expression define three T lymphoblastic lymphoma subsets which might affect clinical outcome[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(3): 692-700.

    [4] NOVAK R L, HARPER D P, CAUDELL D, et al. Gene expression profiling and candidate gene resequencing identifies pathways and mutations important for malignant transformation caused by leukemogenic fusion genes[J]. Exp Hematol, 2012, 40(12): 1016-1027.

    [5] TAN K B, LING L U, BUNTE R M, et al. In vivo efficacy of a novel liposomal formulation of safingol in the treatment of acute myeloid leukemia[J]. J Control Release, 2011, 160(2): 290-298.

    [6] LIEM N L, PAPA R A, MILROSS C G, et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies[J]. Blood, 2004, 103(10): 3905-3914.

    [7] BOHLANDER S K, MUSCHINSKY V, SCHRADER K, et al. Molecular analysis of the CALM/AF10 fusion: identical rearrangements in acute myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia and malignant lymphoma patients[J]. Leukemia, 2000, 14(1): 93-99.

    [8] KOBAYASHI H, HOSODA F, MASEKI N, et al. Hematologic malignancies with the t(10;11) (p13;q21)have the same molecular event and a variety of morphologic or immunologic phenotypes[J]. Genes Chromosomes Cancer, 1997, 20(3): 253-259.

    [9] CAUDELL D, ZHANG Z, CHUNG Y J, et al. Expression of a CALM-AF10 fusion gene leads to Hoxa cluster over expression and acute leukemia in transgenic mice[J]. Cancer Res, 2007, 67(17): 8022-8031.

    [10] FABER J, KRIVTSOV A V, STUBBS M C, et al. HOXA9 is required for survival in human MLL-rearranged acute leukemias[J]. Blood, 2009, 113(11): 2375-2385.

    [11] TEDESCHI F A, CARDOZO M A, VALENTINI R, et al. Coexpression of HoxA9 and bcr-abl genes in chronic myeloid leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 2010, 51(5): 892-896.

    [12] FORRESTER A M, GRABHER C, MCBRIDE E R, et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis[J]. Br J Haematol, 2011, 155(2): 167-181.

    [13] ORLOVSKY K, KALINKOVICH A, ROZOVSKAIA T, et al. Down-regulation of homeobox genes MEIS1 and HOXA in MLL-rearranged acute leukemia impairs engraftment and reduces proliferation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(19): 7956-7961.

    Effects of RNA interference targeting HOXA9 on the proliferation of U937 cells in vitro and in vivo

    JIA Xiu-hong, ZHANG Yan-jun, LI Jian-chang (Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou Shandong 256603, China)

    JIA Xiu-hong E-mail: jiaxiuhong001@163.com

    Background and purpose:In most acute myeloid leukemia(AML) patients, HOXA9 was highly expressed, the high expression of HOXA9 is related to the poor prognosis of patients. This study aimed to investigate the effects of lentivirus-mediated short hairpin RNA targeting HOXA9 gene on the proliferation of U937 cells in vitro and in vivo. Methods:U937 cells were divided into interference group, negative control group and blank control group. The infection efficiency of lentivirus for U937 was detected by flow cytometry, the expression of HOXA10 at protein level was detected by Western blot. Cell cycle was assayed by FCM. Cell growth curves were obtained by calculating the cell number. In vitro experiments were performed using nude mice injected intraperitoneally with the interference group U937 cell(or negative group U937 cell) and subsequently treated with VCR or PBS intraperitoneally. Results:The ratio of GFP positive cells was up to 90%; the levels of HOXA9 protein in interference group were decreased by 54.44% compared with the blank control group(P<0.05). Interference group cells were blocked in G0/G1and their proliferation was significantly inhibited. In vivo: down-regulated expression of the HOXA9 gene combined with VCR could significantly prolong the survival time of nude mice. Conclusion:Lentiviral vector mediated shRNA can steadily reduce the expression level of HOXA9 gene, and then inhibits the proliferation of U937 cells in nude mice.

    HomeoboxA9; RNA interference; U937 cells; Leukemia

    R733.71

    :A

    :1007-3639(2013)02-0120-06

    2012-09-17

    2012-11-12)

    賈秀紅 E-mail:jiaxiuhong001@163.com

    DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.007

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