二氫嘧啶脫氫酶基因IVS14+1多態(tài)性聯(lián)合氟尿嘧啶血藥濃度檢測(cè)在預(yù)測(cè)及減少結(jié)直腸癌氟尿嘧啶為基礎(chǔ)化療不良反應(yīng)中的作用

蔡訊方玨敏薛鵬宋衛(wèi)峰胡炯顧鴻莉楊海燕王理偉

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200080；

2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200072

二氫嘧啶脫氫酶基因IVS14+1多態(tài)性聯(lián)合氟尿嘧啶血藥濃度檢測(cè)在預(yù)測(cè)及減少結(jié)直腸癌氟尿嘧啶為基礎(chǔ)化療不良反應(yīng)中的作用

蔡訊1方玨敏2薛鵬1宋衛(wèi)峰1胡炯1顧鴻莉1楊海燕1王理偉1

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200080；

2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200072

背景與目的：由于個(gè)體差異，5-FU按常規(guī)給藥可能發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，二氫嘧啶脫氫酶基因(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)是5-FU代謝關(guān)鍵酶，DPD單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的差異是影響其活性的主要原因，而IVS14+1據(jù)報(bào)道約占DPD SNPs的一半以上，國(guó)內(nèi)有關(guān)IVS14+1預(yù)測(cè)5-FU不良反應(yīng)的報(bào)道很少。本研究回顧性分析80例局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者DPD IVS14+1多態(tài)性與不良反應(yīng)之間的關(guān)系，明確其在預(yù)測(cè)和減少不良反應(yīng)中的作用。方法：80例不可切除局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在化療前采血應(yīng)用HRM曲線分析進(jìn)行DPD SNPs的檢測(cè)，于每個(gè)周期5-FU持續(xù)滴注開始后12 h應(yīng)用HPLC檢測(cè)5-FU血藥濃度(4～6 Am)，分別取各周期血藥濃度的平均值，通過(guò)逐步回歸分析篩選與5-FU血藥濃度的相關(guān)因素，在大于有效預(yù)測(cè)值下限的患者中回顧性分析DPD IVS14+1 SNPs與不良反應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果：在5-FU平均血藥濃度大于有效預(yù)測(cè)值的下限26.83 mg/L的56例患者中，DPD IVS14+1突變型患者骨髓抑制、手足綜合征和腹瀉(尤其是Ⅲ、Ⅳ度)的發(fā)生率顯著高于野生型患者(13/56 vs 43/56，P分別為0.04、0.03和0.04)，而在mPFS和mOS中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［mPFS：(7.50±0.44)個(gè)月 vs (8.50±0.40)個(gè)月，P=0.69；mOS：(21.00±1.12)個(gè)月 vs (20.00±1.16)個(gè)月，P=0.72］。結(jié)論：局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在接受5-FU為基礎(chǔ)的方案化療前DPD IVS14+1發(fā)生突變及化療后5-FU濃度升高，下次化療前應(yīng)進(jìn)行5-FU劑量調(diào)整，其中雜合型應(yīng)根據(jù)5-FU血藥濃度適當(dāng)減量以減輕不良反應(yīng)，而純合型則應(yīng)避免應(yīng)用5-FU類藥物。

腸腫瘤；血藥濃度；氟尿嘧啶；藥物監(jiān)測(cè)；化療反應(yīng)

結(jié)直腸癌在我國(guó)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，50%～60%的患者在診斷時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，化療是主要的綜合治療手段之一。盡管目前結(jié)直腸癌的化療已從氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)單藥治療進(jìn)入了新藥聯(lián)合化療及分子靶向治療的時(shí)代，但5-FU作為結(jié)直腸癌基礎(chǔ)化療藥物的地位仍未被動(dòng)搖。在常規(guī)按照體表面積給藥時(shí)由于個(gè)體差異的關(guān)系，同樣的劑量可能產(chǎn)生不同療效和不良反應(yīng)，有些不良反應(yīng)可能不可耐受甚至危及生命。一項(xiàng)隨機(jī)、多中心關(guān)于晚期結(jié)直腸癌5-FU單藥化療的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)體表面積計(jì)算用量的傳統(tǒng)治療組客觀有效率為18.3%，而根據(jù)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行劑量調(diào)節(jié)組則可達(dá)33.7%(P=0.004)，兩組的中位總生存(median overall survival，mOS)分別為16和22個(gè)月(P= 0.08)［1］，而目前5-FU與奧沙利鉑(oxaliplatin)、伊立替康等新藥聯(lián)合一線治療的緩解率為40%～50%［2-3］，僅提高約10%，這表明5-FU在治療中的作用還是不可或缺的。二氫嘧啶脫氫酶基因(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)是5-FU代謝的限速酶，在體內(nèi)80%～85%的5-FU經(jīng)過(guò)肝臟的DPD被滅活，而DPD酶缺陷的患者在應(yīng)用5-FU時(shí)可能產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［4-6］。目前為止，已發(fā)現(xiàn)DPD有30余種單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)及缺失突變，其中最常見(jiàn)的是DPD第1986位剪切點(diǎn)(即14G1A位點(diǎn))發(fā)生G-A的轉(zhuǎn)化(DPYD*2A)，約占突變總發(fā)生率的50%，可導(dǎo)致外顯子14的缺失，致使DPD活性減低甚至喪失［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在使用5-FU治療而發(fā)生不良反應(yīng)的大腸癌患者中，有27%～57%帶有DPYD*2A型［8］。目前通過(guò)5-FU血藥濃度聯(lián)合DPD基因型檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)5-FU個(gè)體化治療的研究還很少，因此本研究擬通過(guò)化療前檢測(cè)DPD基因型協(xié)同化療后5-FU血藥濃度檢測(cè)回顧性分析其與不良反應(yīng)之間的關(guān)系，以達(dá)到對(duì)化療患者5-FU的治療劑量進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整，進(jìn)一步避免和減少不良反應(yīng)的目的。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

上海市第一人民醫(yī)院2008年6月—2010年10月住院并經(jīng)病理和影像學(xué)資料證實(shí)為不可手術(shù)局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者共80例，其中男性48例，女性32例。年齡32～76歲，中位年齡58歲。病理類型：低分化腺癌28例，中分化腺癌16例，高分化腺癌12例，黏液腺癌8例，管狀腺癌16例。結(jié)腸癌58例，直腸癌22例。按照《AJCC癌癥分期手冊(cè)》第六版分期法：ⅢB期6例，Ⅳ期74例。體能狀態(tài)采用ECOG評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，為0～2分。所有患者均具有可測(cè)量病灶，生存時(shí)間≥3個(gè)月。所有患者接受FOLFOX-6方案一線化療3個(gè)周期。根據(jù)化療后測(cè)定的5-FU血藥濃度計(jì)算平均值，在5-FU有效濃度預(yù)測(cè)區(qū)間下限以上的患者進(jìn)行回顧性分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

患者于化療前抽取外周血5 mL，1 000×g離心15 min，保留血清采用高分辨率熔解(high resolution melting，HRM)曲線分析進(jìn)行DPD 14G1A SNPs檢測(cè)［9］，隨后接受FOLFOX-6方案一線治療：奧沙利鉑100 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天；亞葉酸鈣 200 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天；5-FU 400 mg/m2靜脈推注，然后改為3 000 mg/m2靜脈滴注46 h，每2周重復(fù)。每個(gè)周期5-FU持續(xù)靜脈滴注開始后12 h(均在4～6 Am)抽取靜脈血2 mL，應(yīng)用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定5-FU血藥濃度［10］。

1.2.1 外周血DPD 14G1A SNPs檢測(cè)

采用血清DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)：在2 mL離心管內(nèi)加入40 μL 蛋白酶K，再加入400 μL血清樣品，充分振蕩后56 ℃水浴10 min，并加入400 μL無(wú)水乙醇振蕩混勻，將上述混合物分2次過(guò)柱(每次620 μL)：6 000×g離心1 min后將離心柱置于新的2 mL離心管內(nèi)，加入500 μL的緩沖液 AW1，6 000×g離心1 min后將離心柱置于新的2 mL離心管，加入500 μL的緩沖液AW2，20 000×g離心3 min后將離心柱置于新的2 mL離心管，管中加入50 μL緩沖液AE，室溫靜置5 min，再以6 000×g離心1 min后行核酸定量，-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)參照Malate脫氫酶基因序列，由Invitrogen公司合成。引物序列上游引物：5’-ACTAAAGGCTGACTTTCCAGACAAC-3’；下游引物：5’-AACATTCACCAACTTATGCC AA-3’。 PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR緩沖液(20 mmol/L MgCl2)2 μL、MgCl2(25 mmol/L)0.4 μL、dNTP(10 mmol/L)0.5 μL、20×Eva-green飽和染料1 μL、10 μmol/L引物1 μL、DNA模板 1 μL、Taq酶(5 U/μL)0.2 μL、ddH2O 13.9 μL。置于LightCycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增程序(圖1)，自65 ℃開始以45°的斜率采集熔解曲線，至95 ℃結(jié)束，用LightScanner Call IT軟件對(duì)采集后的曲線進(jìn)行分析?；厥占兓瘮U(kuò)增的PCR產(chǎn)物片段，用DNA 3730分析儀進(jìn)行序列分析。

1.2.2 5-FU血藥濃度檢測(cè)

取5-FU標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，美國(guó))配制成200 ng/mL的5-FU標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取5-溴脲嘧啶(5-bromouracil，5-Bru，上海眾富公司)標(biāo)準(zhǔn)品配制成200 ng/mL的5-Bru內(nèi)標(biāo)液。于空白血漿中分別加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使其濃度為0.5、1、2.5、5、10、25和50 ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)液，加入200 ng/mL的5-Bru內(nèi)標(biāo)液25 μL和10%高氯酸20 μL，振蕩2 min后離心10 min (5 000 r/min)，取上清液過(guò)濾后進(jìn)樣20 μL。HPLC色譜系統(tǒng)由510系列泵、490紫外檢測(cè)器(Waters公司，美國(guó))和Diamonsil C18柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm粒徑，美國(guó)迪馬公司)組成，流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55，V /V) ，流速為1. 3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

圖 1 5-FU標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測(cè)值的分布情況Fig. 1 Distribution of standardized 5-FU predictive value

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

所有患者于治療3個(gè)周期后行第1次評(píng)價(jià)，并于4周后進(jìn)行療效確認(rèn)。按照RECIST實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)。不良反應(yīng)按照國(guó)立癌癥研究所的常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)(NCI-CTC)3.0版分為0～Ⅳ度。疾病進(jìn)展后每2個(gè)月隨訪1次，中位隨訪時(shí)間16個(gè)月(8～26個(gè)月)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

信息量分析模型不僅可以定量地反映出地質(zhì)災(zāi)害發(fā)育規(guī)律，使用起來(lái)又簡(jiǎn)單易行，在地質(zhì)災(zāi)害易發(fā)性評(píng)價(jià)中得到了廣泛地應(yīng)用和推廣。信息量分析模型公式如下：

計(jì)量資料采用x±s 表示。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用Kalplan-Meier進(jìn)行生存分析，log-rank檢驗(yàn)分析生存差異；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，不良反應(yīng)程度、血藥濃度及緩解率方面的組間差異采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5-FU血藥濃度與各影響因素的逐步回歸分析

以5-FU血藥濃度為因變量，不良反應(yīng)、近期療效、PFS和OS為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-FU血藥濃度與骨髓抑制、手足綜合征、腹瀉、OS及DPD基因型相關(guān)(表1)，5-FU標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測(cè)值的殘差頻率呈正態(tài)分布(圖1A)，5-FU預(yù)測(cè)值呈線性分布(預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖及回歸線圖1B)，5-FU血藥濃度與DPD基因型Pearson系數(shù)為0.52，P=0.00，也表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 DPD基因多態(tài)性

根據(jù)回歸分析中5-FU校正的標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測(cè)值及標(biāo)準(zhǔn)誤(33.72±6.89)mg/L將患者分為3組，3組間的臨床特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)，將平均血藥濃度大于有效預(yù)測(cè)值的下限26.83 mg/L的56例(即第2、3組)進(jìn)行基因多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)(圖2)， DPD 14G1A未發(fā)生轉(zhuǎn)變(即G/G)者43例，發(fā)生雜合子突變者(即G/A)者11例，發(fā)生純合子突變 (即A/A)者2例。將G/G者定義為野生組，將G/A和A/A者定義為突變組，第1組均為G/ G型，因此5-FU血藥濃度＞26.83 mg/L患者DPD 14G1A突變率為23.21%(13/56)。

表 1 回歸方程系數(shù)Tab. 1 Coefficient of the regression equation

表 2 三組間患者臨床特征比較Tab. 2 Comparison of clinical characteristics of the 3 groups (n)

圖 2 DPD基因14G1A位點(diǎn)各基因型的高分辨率熔解曲線Fig. 2 Melting curves of different single nucleotide polymorphisms for 14G1A sites in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene

2.3 療效比較及DPD基因型與不良反應(yīng)的關(guān)系

野生組與突變組中位PFS和OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表3，圖3)。

將第2、3組按DPD野生型和突變型區(qū)分進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，突變組在骨髓抑制、手足綜合征和腹瀉(尤其是Ⅲ、Ⅳ度)的發(fā)生率顯著高于野生組(P分別為0.04、0.03和0.04，表4)。

表 3 野生和突變組療效比較Tab. 3 Comparison of efficacy between the wild type and mutant groups

圖 3 野生和突變組PFS和OS的比較Fig. 3 Comparison of progression-free survival and overall survival between the wild type and mutant groups

表 4 野生和突變組不良反應(yīng)的比較Tab. 4 Comparison of adverse reactions between the wild type and mutant groups

3 討 論

由于5-FU血藥濃度檢測(cè)具有“事后性”的缺點(diǎn)，故對(duì)于首次化療后5-FU血藥濃度升高的患者，為了避免在下次用藥時(shí)可能產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)則需要事先了解DPD的活性，因?yàn)榻^大部分5-FU在體內(nèi)經(jīng)DPD代謝，而DPD等位基因突變可導(dǎo)致DPD活性部分或完全喪失［12］。在目前已發(fā)現(xiàn)DPD的30余種SNPs及缺失突變中最常見(jiàn)的是IVS14+1G＞A。IVS14+1G＞A位于外顯子14和內(nèi)含子14的交界處，原有的基因剪切位點(diǎn)由G突變?yōu)锳，因此基因剪切位點(diǎn)消失，造成轉(zhuǎn)錄的mRNA缺少外顯子14，導(dǎo)致成熟的DPD mRNA缺乏一段含165個(gè)核苷酸的片段，缺乏581-635氨基酸的突變DPD蛋白無(wú)催化活性［13］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IVS14+1G＞A在一般人群中的突變率約為3%［8］，但在日本及臺(tái)灣的小樣本人群中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變［14］。本研究發(fā)現(xiàn)56例結(jié)直腸癌患者發(fā)生IVS14+1G＞A突變者共13，其中雜合子突變者(即G/A)11例，純合子突變者(即A/A)2例，突變率為23.21%，該結(jié)果高于已有文獻(xiàn)報(bào)道，原因可能為：①樣本量還不夠大，可能會(huì)產(chǎn)生發(fā)表偏倚；②不同種族之間存在差異；③本研究采用了敏感性和特異性均較高的HRM技術(shù)，能檢測(cè)的變異體低至2%，而傳統(tǒng)PCR測(cè)序僅能檢測(cè)低至20%的變異體。

將平均血藥濃度大于有效預(yù)測(cè)值下限26.83 mg/L的56例患者按DPD基因型分為野生型和突變型兩組進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，突變組在骨髓抑制、手足綜合征和腹瀉(尤其是Ⅲ、Ⅳ度)等不良反應(yīng)的發(fā)生率顯著高于野生型組，其中2例純合子突變者均發(fā)生Ⅳ度骨髓抑制，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致［15-16］。而在mPFS和mOS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但DPD又是影響5-FU血藥濃度的主要因素，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能為：①DPD IVS14+1G＞A突變發(fā)生率較低；②DPD基因型與表型可能不一致［8］，存在影響DPD活性的其他類型突變，或存在復(fù)合型突變［17-18］，這需要進(jìn)一步測(cè)定DPD活性加以驗(yàn)證。

綜上所述，通過(guò)對(duì)局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者化療前DPD IVS14+1基因多態(tài)性及化療后5-FU血藥濃度進(jìn)行回顧性分析后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于5-FU血藥濃度在有效濃度以上者，若能在用藥之前獲得DPD IVS14+1 SNPs的信息，則可以進(jìn)一步減少和避免不良反應(yīng)的發(fā)生(表現(xiàn)在DPD IVS14+1突變患者中，雜合型應(yīng)根據(jù)5-FU血藥濃度適當(dāng)減量以減輕不良反應(yīng)，而純合型則應(yīng)避免由于應(yīng)用5-FU類藥物而產(chǎn)生嚴(yán)重甚至威脅生命的不良反應(yīng))，以此提高5-FU個(gè)體化治療的水平。

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IVS14+1 G＞A genotype in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene: a predictive marker with fluorouracil pharmacokinetic in reducing adverse reactions of fluorouracil-based chemotherapy in patients with local advanced and metastatic colorectal cancer

CAI Xun1, FANG Jue-min2, XUE Peng1, SONG Wei-feng1, HU Jiong1, GU Hong-li1, YANG Hai-yan1, WANG Li-wei1(1.Department of Oncology, Shanghai First People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China; 2.Department of Oncology, Shanghai Tenth People’s Hospital, Shanghai Tongji University, Shanghai 200072, China)

WANG Li-wei E-mail: yzwlw@yahoo.com

Background and purpose：Serious adverse reactions may happen in the routine administration of fluorouracil (5-FU) due to individual differences, DPD is the rate-limiting enzyme in the catabolism of 5-FU, single nucleotide polymorphisms (SNPs) in DPD gene is the main reason affecting the activity of DPD, while IVS14+1 G＞A accounted for about 50% of the total mutation, reports such as IVS14+1 G＞A forecasting 5-FU associated adverse reactions was rare, so we retrospectively investigated the relationship between IVS14+1 G＞A genotype in the dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) gene and 5-FU associated adverse reactions in 80 patients with locally advanced or metastatic colorectal cancer, in order to confirm the role of DPD IVS14+1 G＞A genotype in predictingand reducing adverse reactions of 5-FU-based chemotherapy. Methods：Eighty patients with unresectable locally advanced or metastatic colorectal cancer were enrolled. Single nucleotide polymorphisms for DPD gene were analyzed before chemotherapy by high-resolution melting (HRM) analysis, and the plasma concentration of 5-FU was detected by high performance liquid chromatography (HPLC) after continuous infusion of 5-FU over 12 h in each cycle. The factors related to plasma concentration of 5-FU were screened by stepwise regression. The relationship between DPD IVS14+1 genotype and adverse reactions was retrospectively analyzed in 56 patients whose plasma concentrations were greater than predicted lower limit. Results：Of the 56 patients whose plasma concentration were greater than 26.83 mg/L, the predicted lower limit, the incidence of bone marrow suppression, hand-foot syndrome and diarrhea for DPD IVS14+1 mutant patients were both higher than those DPD IVS14+1 wide type ones (P=0.04, P=0.03 and P=0.04), while there were no difference in median progression free survival (mPFS) and median OS (mOS) (mPFS: 7.50±0.44 months vs 8.50±0.40 months, P=0.69; mOS: 21.00±1.12 months vs 20.00±1.16 months, P=0.72). Conclusion：The patients with DPD IVS14+1 G＞A mutation and higher 5-FU plasma concentration need to adjust 5-FU dosage in next chemotherapy: for patients with DPD heterozygous mutation, 5-FU dose should be appropriately reduced according to last plasma concentration to reduce adverse reactions, while the homozygous ones should avoid application of 5-FU and its derivatives.

Colonic neoplasms; Plasma concentration; 5-FU; Drug monitoring; Chemotherapy side effects

R735.3+5

：A

：1007-3639(2013)02-0130-07

2012-05-28

2012-12-20）

王理偉 E-mail:yzwlw@yahoo.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.02.009