毛細(xì)管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定葡萄酒中8種有機(jī)酸含量

李永庫(kù)，劉衣南，呂琳琳，李曉靜，王 芬

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114005；3.中州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 鄭州 450044）

有機(jī)酸是葡萄酒的主要成分之一，葡萄酒中的酸度主要由有機(jī)酸決定，有機(jī)酸的種類、濃度與葡萄酒的類型、品質(zhì)有很大關(guān)系，它們影響著葡萄酒的口感、色澤及生物穩(wěn)定性，因此，對(duì)葡萄酒中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)十分重要。目前已有采用高效液相色 譜法［1－6］、離子 色譜法［7－9］、高 效 液相色譜－質(zhì)譜 聯(lián) 用 法［10］和 毛 細(xì) 管 電 泳 法［11－16］測(cè)定葡萄酒中多種有機(jī)酸含量的報(bào)道，但采用毛細(xì)管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸尚未見報(bào)道。

毛細(xì)管電泳（CE）儀具有分離選擇性易調(diào)節(jié)、分離效率高、速度快、有機(jī)溶劑和樣品消耗少、樣品處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種復(fù)雜樣品中痕量物質(zhì)的分析方法。毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE／MS）可以克服常用的毛細(xì)管電泳－紫外檢測(cè)方法中靈敏度不高、定性能力差的不足，在一次分析中可同時(shí)得到組分遷移時(shí)間、分子質(zhì)量和碎片特征信息，為復(fù)雜樣品的定性、定量分析提供了一種強(qiáng)有力的手段［17］。但是，毛細(xì)管電泳常用的非揮發(fā)性表面活性劑和緩沖體系會(huì)降低大氣壓電噴霧電離源（ESI）的電噴霧效率和污染離子源［18－19］，限制了 CE／MS的聯(lián)用。而海美溴銨作為改性劑，能夠與毛細(xì)管內(nèi)壁形成比較牢固的吸附層，不易被緩沖液沖掉，從而大大減少了表面活性劑對(duì)樣品電離的影響［20］。實(shí)驗(yàn)表明，海美溴銨－醋酸銨緩沖體系對(duì)有機(jī)酸在ESI電離源的電離強(qiáng)度沒(méi)有明顯的影響。本研究擬建立毛細(xì)管電泳－電噴霧質(zhì)譜（CE－ESI－MS）測(cè)定葡萄酒中8種有機(jī)酸的方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent HP3DCE毛細(xì)管電泳儀和1100 MSD TRAP SL 質(zhì)譜儀：美國(guó) Agilent公司產(chǎn)品，通過(guò)CE／MS噴霧組件連接；鞘流液：由Agilent1100等梯度泵和1∶100分流器提供；未涂層彈性石英毛細(xì)管（50μm×83cm）：河北永年銳豐色譜器件廠產(chǎn)品；Orion868型pH／ISE測(cè)試儀：美國(guó)奧立龍公司產(chǎn)品；Sartorius 215S電子天平：德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；Waters Pro Plus超純水儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純）：美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；氨水、醋酸、醋酸銨（分析純）：上海試劑一廠產(chǎn)品；海美溴銨（分析純）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各1.0mg草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸，用水溶解并定容至1mL容量瓶，得到1g／L各酸的儲(chǔ)備液。密封置于4℃下保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1.3 樣品的制備

吸取20.0mL混合均勻的葡萄酒樣，以10 000r／min離心10min，除去不溶物，用緩沖溶液準(zhǔn)確定容至20.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后作為供試品溶液。

1.4 電泳分離條件

以40.0mmol／L醋酸銨（用1.0mol／L醋酸調(diào)至pH 4.5）為運(yùn)行緩沖溶液，未涂層彈性石英毛細(xì)管（50μm×80cm），壓力進(jìn)樣（5kPa×8s），分離電壓25kV，分離溫度25℃。毛細(xì)管柱插入質(zhì)譜前先活化，每天用0.1mol／L氫氧化鈉沖洗30min，然后分別用水、1.5mmol／L海美溴銨和緩沖溶液各沖洗3min。所有溶液使用前均經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，并用超聲波脫氣5min，同一緩沖溶液運(yùn)行3～4次后應(yīng)更換。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI源，負(fù)離子模式），在m／z50～200進(jìn)行全離子掃描，然后選擇m／z89.1（草酸）、115.1（富馬酸）、117.1（琥珀酸）、191.1（檸檬酸）、133.2（蘋果酸）、175.1（抗壞血酸）、149.0（酒石酸）和89.1（乳酸）帶負(fù)電荷的準(zhǔn)分子離子峰峰面積用于定量；毛細(xì)管電壓4.0 kV；噴霧氣（N2）壓力8.27×104Pa；干燥氣（N2）流速10L／min，溫度350℃；鞘液組成：30%異丙 醇 （含 3.0mmol／L 氨 水）；鞘 液 流速6μL／min。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 表面活性劑的種類和濃度對(duì)分離的影響

毛細(xì)管電泳法常用的表面活性劑有十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）、十四烷基三甲基溴化銨（TTAB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。但由于DTAB、TTAB和CTAB不易揮發(fā)，影響樣品的電離，大大降低了質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，因此不能使用。而海美溴銨作為改性劑，其主要優(yōu)點(diǎn)是能形成比較牢固的吸附層，不易被緩沖液沖掉［20］。因此在將毛細(xì)管插入質(zhì)譜前先用海美溴銨沖洗，然后用緩沖溶液沖洗10min，可以大大減少表面活性劑對(duì)樣品電離的影響。

本研究考察了不同濃度的海美溴銨對(duì)有機(jī)酸遷移時(shí)間的影響，示于圖1。隨著海美溴銨濃度的增加，有機(jī)酸遷移時(shí)間減少。當(dāng)海美溴銨濃度大于2.0mmol／L時(shí)，檸檬酸和蘋果酸部分重疊；而當(dāng)海美溴銨濃度等于1.5mmol／L時(shí)，各酸的分離度和電離強(qiáng)度均較好。

圖1 海美溴銨濃度對(duì)遷移時(shí)間的影響Fig.1 Effect of hexadimethrine bromide concentration on the migration times

2.1.2 緩沖溶液pH值對(duì)分離的影響 有機(jī)酸為弱酸，其pKa值大多在2～6之間，有機(jī)酸的有效遷移率大小在很大程度上取決于緩沖液的pH值。因此緩沖溶液的pH值是影響毛細(xì)管電泳分離的關(guān)鍵因素，pH值的改變將引起電滲流（EOF）、峰形及分離度的變化。本研究在pH 3～7的范圍內(nèi)考察緩沖溶液的pH值對(duì)分離情況的影響，示于圖2。結(jié)果表明，遷移時(shí)間隨著pH的增加而減少，但pH值小于或大于5.0時(shí)，都有部分酸分不開，當(dāng)pH等于5.0時(shí)，各酸的分離效果均較好。

圖2 pH值對(duì)有機(jī)酸遷移時(shí)間的影響Fig.2 Effect of pH on the migration times of the organic acids

2.1.3 緩沖溶液種類和濃度對(duì)分離的影響

由于質(zhì)譜中必須使用易揮發(fā)的緩沖溶液，難揮發(fā)鹽的緩沖溶液（如磷酸鹽等）容易堵塞噴霧口、污染噴霧室、影響樣品的電離。因此本研究選擇了易揮發(fā)性的銨鹽，如甲酸銨和醋酸銨作為緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)醋酸銨的分離效果比甲酸銨好。不同濃度的乙酸銨緩沖溶液對(duì)分離度的影響也不同，有機(jī)酸的遷移時(shí)間隨緩沖溶液濃度的增加而加長(zhǎng)，從而改善分離度。但是緩沖溶液濃度太大，會(huì)產(chǎn)生焦耳熱效應(yīng)，引起區(qū)帶增寬和分析時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)各酸的電離強(qiáng)度也降低。綜上，緩沖溶液的濃度為40.0mmol／L時(shí)，樣品分離效果和電離強(qiáng)度較好。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了全掃描模式（FS）和選擇離子掃描模式（SIM），發(fā)現(xiàn)FS模式下8種有機(jī)酸的靈敏度略好于SIM模式，靈敏度比對(duì)結(jié)果列于表1。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇FS模式。

鞘液是影響電噴霧電離條件的重要因素，選擇合適的鞘液有利于樣品離子化過(guò)程中液滴的去溶劑化，能夠促進(jìn)樣品電離，降低背景信號(hào)。對(duì)比了甲醇、異丙醇、乙腈對(duì)樣品電離的影響，結(jié)果顯示，使用異丙醇作為鞘液時(shí)，背景噪音低且樣品電離強(qiáng)度大，當(dāng)異丙醇濃度達(dá)30%時(shí)，響應(yīng)值最高。

表1 全掃描模式與選擇離子掃描模式的靈敏度對(duì)比（S／N＝3，mg／L）Table 1 Comparison of eight acids sensitivity by FS and SIM（S／N＝3，mg／L）

甲酸、乙酸、氨水是常用的鞘液添加劑，在30%異丙醇溶液中分別添加了甲酸、乙酸、氨水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加氨水效果最佳。綜合考慮8種組分的檢測(cè)靈敏度，選擇3mmol／L氨水作為鞘液添加劑，其濃度對(duì)電離的影響示于圖3。

2.3 鞘液的流速對(duì)樣品電離的影響

本研究考察了不同鞘液流速對(duì)樣品電離的影響。當(dāng)流速?gòu)?μL／min升到6μL／min時(shí)，樣品的電離強(qiáng)度隨著流速的增加而升高；當(dāng)流速大于8μL／min時(shí)，樣品的電離強(qiáng)度反而降低，因?yàn)榍室旱牧魉偬?，?duì)樣品有稀釋作用。因此選擇鞘液的流速為6μL／min。

圖3 鞘液中氨水的濃度對(duì)電離的影響Fig.3 Effect of the concentration of the ammonium in sheath liquid on ionization

2.4 樣品的色譜圖及定性分析

在優(yōu)化的條件下，8種組分在15min內(nèi)獲得分離度較好的總離子流色譜圖，示于圖4。根據(jù)各組分的出峰時(shí)間和一級(jí)質(zhì)譜m／z值進(jìn)行定性分析。

2.5 線性關(guān)系及檢出限

配制一系列不同濃度的草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定。以8種有機(jī)酸的分子離子峰的峰面積對(duì)濃度（mg／L）進(jìn)行線性回歸，以峰面積外標(biāo)法定量，得到分析物回歸方程及相關(guān)系數(shù)，以S／N＝3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得各物質(zhì)的檢出限，列于表2。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of standard mixture（a）and samples（b）

2.6 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

將同一樣品分別取2份，其中一份作為本底，另一份準(zhǔn)確加入一定量8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3的方法處理成待測(cè)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)每份樣品平行測(cè)定5次，按照外標(biāo)法定量并計(jì)算其回收率，結(jié)果列于表3。

2.7 樣品分析

按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)市售的5種葡萄酒的有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表4。

表2 8種有機(jī)酸的線性關(guān)系和檢出限Table 2 The linear range and detection limit of eight organic acids

表3 樣品加標(biāo)回收率（n＝5）Table 3 Recovery of the method（n＝5）

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n＝5）Table 4 Results of sample analysis（n＝5）

3 結(jié)論

本研究采用毛細(xì)管電泳－電噴霧電離質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定了葡萄酒中草酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、酒石酸和乳酸8種有機(jī)酸含量，該方法不需衍生，前處理簡(jiǎn)單、快速、專一性強(qiáng)，靈敏度、重現(xiàn)性好，適合復(fù)雜體系中有機(jī)酸成分的分析。

［1］ 呂旭聰，黃志清，黃若蘭，等.反相高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定黃酒和葡萄酒中有機(jī)酸的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（6）：131－135.LV Xucong，HUANG ZHiqing，HUANG Ruolan，et al.Simultaneous determination of organic acids in wine with reverse－phase high performance liquid chromatography［J］.Food and Fermentation Industries，2010，36（6）：131－135（in Chinese）.

［2］ 崔 婧，段長(zhǎng)青，潘秋紅.反相高效液相色譜法測(cè)定葡萄中的有機(jī)酸［J］.中外葡萄與葡萄酒，2010，（5）：25－30.CUI Jing，DUAN Changqing，PAN Qiuhong.Determination of organic acids in grape berry with reversed－phase high performance liquid chromatography［J］.Sino－Overseas Grapevine Wine，2010，（5）：25－30（in Chinese）.

［3］ GONCALVES J，SILVA C L，CASTILHO P C，et al.An attractive，sensitive and high－throughput strategy based on microextraction by packed sorbent followed by UHPLC－PDA analysis for quanti－fication of hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acids in wines［J］.Microchemical Journal，2013，106：129－138.

［4］ ZHENG Y J，DUAN Y T，ZHANG Y F，et al.Determination of organic acids in red wine and must on only one RP－LC－column directly after sample dilution and filtration［J］.Chromatographia，2009，69（11／12）：1 391－1 395.

［5］ ESCOBAL A，GONZALEZ J，IRIONDO C，et al.Liquid chromatographic determination of organic acids in txakoli from Bizkaia［J］.Food Chem，1997，58（4）：381－384.

［6］ LóPEZ E F，GóMEZ E F.Simultaneous determination ofthe major organicacids，sugars，glycerol，and ethanol by HPLC in grape musts and white wines［J］.J Chromatogr Sci，1996，34（5）：254－257.

［7］ ZHU Y，ZHANG X D，NIU W J.Simultaneous determination of carbohydrat es and organic acids in beer and wine by ion chromatography［J］.Mikrochim Acta，1997，127（3／4）：189－194.

［8］ MORALES M L，GONZALEZ A G，TRONCOSO A M.Ion－exclusion－chromatographic determination of organic acids in vinegars［J］.J Chromatogr A，1998，822（1）：45－51.

［9］ 成 霈，劉 佳，顧慧瑩，等.離子色譜法測(cè)定果酒中的有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（8）：175－177.CHENG Pei，LIU Jia，GU Huiying，et al.Determination of organic acid in fruit wine by ion chromatography［J］.Food and Fermentation Industries，2011，37（8）：175－177（in Chinese）.

［10］ FLORES P，HELLíN P，F(xiàn)ENOLL J.Determination of organic acids in fruits and vegetables by liquid chromatography with tandem－mass spectrometry［J］.Food Chem，2012，132（2）：1 049－1 054.

［11］ CASTINEIRA A，PENA R M，HERRERO C，et al.Analysis of organic acids in wine by capillary electrophoresis with direct UV detection［J］.J Food Comp and Anal，2002，15（3）：319－331.

［12］ PERES R G，MORAES E P，MICKE G A，et al.Rapid method for the determination of organic acids in wine by capillary electrophoresis with indirect UV detection［J］.Food Control，2009，20（6）：548－552.

［13］ CASTINEIRA A，PENA R M，HERRERO C，et al.Simultaneous determination of organic acids in wine samples by capillary electrophoresis and UV detection：Optimization with five different background electrolytes［J］.J High Resol Chromatogr，2000，23（11）：647－652.

［14］ CHEN Z L，TANG C，YU J C.Simultaneous determination ofinorganic anions and organic acids in environmental samples by capillary zone electrophoresis with indirect UV detection［J］.J High Resol Chromatogr，1999，22（7）：379－385.

［15］ 唐美華，屠春燕，薛亞芳，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定葡萄酒中的有機(jī)酸含量［J］.食品科學(xué)，2009，30（8）：209－211.TANG Meihua，TU Chunyan，XUE Yafang，et al.Determination of organic acids in grape wine using capillary zone electrophoresis［J］.Food Science，2009，30（8）：209－211（in Chinese）.

［16］ MATO I，SUA′REZ－LUQUE S，HUIDOBRO J F.Simple determination of main organic acids in grape juice and wine by using capillary zone electrophoresis with direct UV detection［J］.Food Chem，2007，102（1）：104－112.

［17］ 梁 振，段繼誠(chéng)，張維冰，等.毛細(xì)管電泳－電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用中緩沖液pH對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的影響［J］.色譜，2003，21（1）：9－12.LIANG Zhen，DUAN Jicheng，ZHANG Weibing，et al.Evaluation of the effects of the pH value of buffer on capillary electrophoresis－electrospray ionization－mass spectrometry signal intensity［J］.Chinese Journal of Chromatography，2003，21（1）：9－12（in Chinese）.

［18］ 周國(guó)華，羅國(guó)安.毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，1998，14（4）：338－344.ZHOU Guohua，LUO Guoan.Capillary electrophoresis－mass spectrometry and its application［J］.Journal of Analytical Science，1998，14（4）：338－344（in Chinese）.

［19］ 許崇峰，申華莉，宋浩威，等.毛細(xì)管電泳－電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2002，21（4）：95－98.XU Congfeng，SHEN Huali，SONG Haowei，et al.Capillary electrophoresis－electrospray mass spectrometry and its application in proteomics［J］.Journal of Instrumental Analysis，2002，21（4）：95－98（in Chinese）.

［20］ TERABE S，IAEMURA T.Effect of polymer ion concentration on migration velocities in ionexchange electrokinetic chromatography［J］.J Chromato A，1990，515：667－676.