天然同位素信息在多級質(zhì)譜裂解規(guī)律解析中的應(yīng)用——以磺胺類化合物為例

張海燕，劉 鑫，嚴(yán) 華，李建輝，韓 深，張朝暉，王金花，許 泓，葉曉霞

（1.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江 溫州 325000；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室，北京 100026；3.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物食品中心，天津 300000）

質(zhì)譜是對未知化合物分子進(jìn)行定性和解析的重要工具［1－5］。通過質(zhì)譜獲得化合物的分子質(zhì)量信息，可以為確定化合物的元素組成提供一定的幫助，但是要獲得化合物的準(zhǔn)確分子式仍有相當(dāng)大的難度。現(xiàn)代的高分辨質(zhì)譜儀（Orbitrap、Q－TOF和FTICR－MS）為未知化合物定性提供了更高的質(zhì)量精度（質(zhì)量誤差小于5×10－6），大大縮小了待選化合物分子式的范圍，但對元素組成復(fù)雜的化合物，即使質(zhì)量誤差小于5×10－6，仍有許多待選分子式［6］。為進(jìn)一步確定化合物的分子組成，應(yīng)用同位素信息對化合物的分子組成進(jìn)行判斷已成為重要的手段［7－9］。應(yīng)用一級質(zhì)譜獲得同位素分布信息，從而確定化合物分子式的方法已在藥物分子［10］及代謝產(chǎn)物的鑒定［6，11－13］、環(huán)境與安全［14］、農(nóng)藥的定性分 析［15］、非目標(biāo)化合物掃描［16－17］以及天然產(chǎn)物研究［18］等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前，人們主要關(guān)注母離子的同位素分布信息，卻很少有文獻(xiàn)報道化合物子離子的同位素豐度和峰形信息。這是由于大部分實(shí)驗(yàn)都是選用目標(biāo)化合物的最豐同位素母離子（most abundant isotopic peak）進(jìn)行裂解，得到僅含有單同位素裂解信息的子離子（monoisotopic peak），這種實(shí)驗(yàn)方法忽略了對天然同位素信息的利用。Alon等［19］使用超聲波三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（supersonic GC／MS）對二級子離子的天然同位素豐度比進(jìn)行研究，并用作者設(shè)計的Tal－Aviv IAA軟件對EI源裂解的化合物碎片同位素信息進(jìn)行分析，通過對離子碎片進(jìn)行解析確定了最匹配的候選分子式。目前，還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道在ESI源下利用高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)信息及同位素豐度信息對化合物子離子的多級質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行分析。

對于高分辨質(zhì)譜，通過精確質(zhì)量過濾可以很好的減少待選分子式，應(yīng)用同位素信息，通過對質(zhì)量軸、質(zhì)譜峰形變異和隨機(jī)噪聲進(jìn)行校正，可以進(jìn)一步減少候選分子式的數(shù)量。質(zhì)譜采集的同位素信息不僅包括同位素豐度比，還包括同位素峰的輪廓信息。應(yīng)用同位素輪廓信息能夠更準(zhǔn)確的從質(zhì)譜圖得到質(zhì)荷比推測分子式［20］。Gu等［21］用 MassWorks軟件校正譜圖，解析同位素輪廓信息，并提出了“譜圖準(zhǔn)確度”（spectral accuracy）的概念。李雪生等［15］運(yùn)用“譜圖準(zhǔn)確度”方法在單位分辨質(zhì)譜儀GC／MS上實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)農(nóng)藥分子式的準(zhǔn)確識別。然而，現(xiàn)有“譜圖準(zhǔn)確度”的文獻(xiàn)僅局限于一級質(zhì)譜的分析，并未在多級質(zhì)譜中應(yīng)用。

本研究采用LTQ－Orbitrap XL高分辨質(zhì)譜儀，通過改變離子阱質(zhì)譜中的重要參數(shù)isolation width，建立在高分辨質(zhì)譜儀上獲得子離子同位素信息的方法，并根據(jù)同位素豐度比和同位素峰形進(jìn)行子離子結(jié)構(gòu)的解析。以磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）子離子的同位素峰信息為例，使用Xcalibur軟件模擬子離子的同位素豐度比與實(shí)測值進(jìn)行比較，通過同位素峰形信息確證子離子的元素組成。為進(jìn)一步確證該法的可行性，本研究運(yùn)用MassWorks軟件對子離子碎片進(jìn)行質(zhì)譜輪廓分析。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

LTQ－Orbitrap XL線性離子阱－軌道離子阱高分辨組合式質(zhì)譜儀：美國ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI源）。

磺胺甲基嘧啶（純度＞98%）：購于Dr.Ehrenstorfer公司；標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇水溶液配制成100μg／L溶液；其他試劑均為色譜純；試驗(yàn)用水為Milli－Q超純水。

1.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)量分析器：Orbitrap；離子化方式：ESI＋；噴霧電壓：4.5kV；管狀透鏡電壓：115V；鞘氣（氮?dú)猓┝魉伲?5L／min；輔助氣（氮?dú)猓┝魉伲?.00L／min；毛細(xì)管溫度：350 ℃；質(zhì)量掃描范圍：m／z50～300；靜電場軌道阱的高分辨掃描：分辨率R＝30 000；高能誘導(dǎo)裂解（HCD裂解），歸一化能量：55%；isolation width：1u或6u。

1.3 試驗(yàn)方法

蠕動泵直接進(jìn)樣，流速10μL／min。按照1.2條件進(jìn)行檢測，記錄總離子流圖、質(zhì)譜圖和精確質(zhì)量數(shù)。通過離子阱的二級質(zhì)譜圖和Xcalibur軟件模擬質(zhì)譜圖對化合物進(jìn)行確認(rèn)，并用MassWorks軟件對子離子碎片進(jìn)一步確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多級質(zhì)譜同位素峰的理論分布

將化合物的同位素峰定義為A、A＋1、A＋2、A＋3和A＋4（A＋i表示i個附加的中子），A為輕同位素峰，A＋1、A＋2、A＋3和A＋4為重同位素峰［8］，同位素豐度的比值以元素同位素的貢獻(xiàn)率計算得出。以含有硫元素的化合物磺胺甲基嘧啶（C11H12N4O2S）為例，其子離子可分為含硫和不含硫兩類，示于圖1［22］。其子離子［C6H6NSO2］＋的 A峰是輕同位素峰［12C6H614N32S16O2］＋，將豐 度 設(shè) 定 為 100%；A＋1 峰 由 ［13C12C5H614N32S16O2］＋（6.48%）、［12C6DH514N32S16O2］＋（0.07% ）、［12C6H615N32S16O2］＋（0.37%）、［12C6H614N33S16O2］＋（0.80%）和［12C6H614N32S17O16O］＋（0.08%）等組成，由于13C 的 同 位 素 豐 度 較2H、15N、17O 和33S高，因此A＋1峰的豐度和峰形主要由［13C12C5H614N32S16O2］＋決定；同理，因34S對 A＋2峰貢獻(xiàn)最大，A＋2的豐度和峰形是由［12C61H614N34S16O2］＋（4.52%）決 定，［12C6H614N32S18O16O］＋（0.42%）、［13C12C5H615N32S16O2］＋（0.02%）等10個峰是 A＋2的次要組成部分。上述各峰共同組成了［C6H6NSO2］＋的A、A＋1和A＋2同位素峰。

2.2 Isolation width對質(zhì)譜采集同位素峰的影響

離子阱的isolation width是獲得多級質(zhì)譜中重同位素信息的重要參數(shù)。當(dāng)isolation width設(shè)為1u時，母離子選擇范圍在［M＋H］＋±0.5u之間，子離子峰僅有m／z108.044 29，其重同位素沒有被選中，而無相應(yīng)的碎片同位素峰，示于圖2a－1。當(dāng)isolation width設(shè)為6u時，即母離子選擇范圍在［M＋H］＋±3.0u之間，除產(chǎn)生m／z108.044 30峰外，還檢測到m／z109.047 45的重同位素峰，示于圖2a－2。同理，對于圖2中列出的其他子離子，當(dāng)isolation width設(shè)為1u時，只產(chǎn)生m／z92.049 33和m／z65.038 40；當(dāng)isolation width設(shè)為6u時，可以檢測到相應(yīng)的重同位素峰m／z93.052 57和m／z66.041 67。這與儀器配套軟件Xcalibur模擬的［C6H6NO］＋（圖2a－3）、［C6H6N］＋（圖2b－3）和［C5H5］＋（圖2c－3）相符，具體相對豐度比列于表1。因此，在試驗(yàn)過程中，選擇isolation width為6u進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3 多級質(zhì)譜同位素峰推測化合物的分子組成

以磺胺甲基嘧啶為例，當(dāng)子離子分子式由C、H、O和N元素組成時，對重同位素豐度比和峰形貢獻(xiàn)較大的主要是C，多級質(zhì)譜的同位素峰應(yīng)包含A和A＋1峰；當(dāng)化合物的分子組成含S時，其同位素峰主要由C和S的含量共同決定，多級質(zhì)譜的同位素峰應(yīng)包含A、A＋1及A＋2峰。通過以上規(guī)律，分析質(zhì)譜采集到的同位素峰的組成，可以判斷化合物的元素信息。

對子離子m／z108.044 39、92.049 48和65.038 58，質(zhì)譜只檢測到相應(yīng)的A和A＋1峰，而無明顯的A＋2峰，可以判斷這幾個子離子是不含S的子離子。對于含S的子離子，m／z156.011 38在質(zhì)譜上產(chǎn)生 A（m／z156.011 38，100.00%）、A＋1（m／z157.014 91，5.26%）和A＋2峰（m／z158.007 13，4.19%），其豐度比符合S元素的分布規(guī)律，這與Xcalibur軟件模擬的［C6H6NSO2］＋（圖2d－3）相符，具體相對豐度比列于表2。

圖1 磺胺甲基嘧啶的結(jié)構(gòu)式及HCD質(zhì)譜裂解Fig.1 The structure and HCD fragmentation pathway of sulfamerazine

表1 磺胺甲基嘧啶離子碎片理論同位素和實(shí)測同位素（isolation width＝6u）分布信息Table 1 Comparison of accurate mass acquired by Orbitrap（isolation width＝6u）and the isotope pattern predicted by the Xcalibur software

圖2 在不同isolation width下磺胺甲基嘧啶子離子同位素豐度信息Fig.2 Tandem mass isotope pattern acquired by Orbitrap in different isolation width

表2 子離子峰m／z 156.011 38和m／z 65.038 58的 MassWorks檢索結(jié)果Table 2 Search result of fragment ion peaks（m／z 156.011 38and m／z 65.038 58）by MassWorks

2.4 由同位素峰輪廓推測化合物的分子組成

用MassWorks對磺胺甲基嘧啶子離子的精確分子質(zhì)量及元素組成進(jìn)行識別。選取精確分子質(zhì)量156.011 4和65.038 3，以離子電荷數(shù)為1，質(zhì)量誤差為5×10－6，C、H、O、N及S為可能含有的元素，利用MassWorks同位素峰形校正檢索技術(shù)（sCLIPS），通過同位素峰形輪廓匹配原則，推測m／z156.011 38和m／z65.038 31的分子式，分別示于圖3和圖4。子離子m／z156.011 4經(jīng)軟件檢索只得到分子式［C6H6NSO2］＋，該分子式的理論值與儀器獲得的m／z156.011 4質(zhì)量誤差為0，A、A＋1和 A＋2同位素峰輪廓顯示很好的匹配性，匹配度達(dá)到96.1%，故推測該離子是［C6H6NSO2］＋；子離子m／z65.038 3經(jīng)軟件檢索只得到分子式［C5H5］＋，該分子式的理論值與儀器獲得的m／z65.038 6質(zhì)量誤差為－4.61×10－6，A、A＋1和A＋2同位素峰輪廓顯示很好的匹配性，匹配度達(dá)到99.2%，故推測該離子是［C5H5］＋。

據(jù)文獻(xiàn)［23］報道，磺胺甲基嘧啶在EI源上裂解產(chǎn)生的子離子m／z65的分子式為HS·＋O2。本研究運(yùn)用ESI源產(chǎn)生質(zhì)荷比為m／z65的子離子，其精確質(zhì)量數(shù)m／z65.038 31與HS·＋O2（計算值m／z64.969 18）質(zhì)量誤差為1.06×10－4，推斷該子離子的分子式不是HS·＋O2。根據(jù)本研究的結(jié)果，證明了m／z65.038 31對應(yīng)的分子式是［C5H5］＋。

圖3 MassWorks準(zhǔn)確識別m／z 156.011 4分子式的結(jié)果Fig.3 The spectral accuracy and mass error of［C6H6NSO2］＋ （m／z 156.011 4）with mono isotope value showed by MassWorks software

圖4 Mass Works準(zhǔn)確識別m／z 65.038 3分子式的結(jié)果Fig.4 The spectral accuracy and mass error of［C5H5］＋ （m／z 65.038 3）with mono isotope value showed by MassWorks software

2.5 方法驗(yàn)證

用磺胺對甲氧嘧啶對該方法進(jìn)行驗(yàn)證，碎片離子m／z156.011 38 在質(zhì)譜上產(chǎn)生 A（m／z156.011 34，100.00%）、A＋1（m／z157.014 51，5.42%）和 A＋2峰（m／z158.006 99，3.01%），其豐度比符合S元素的分布規(guī)律，示于圖5。對于碎片離子m／z108.044 39，質(zhì)譜只檢測到相應(yīng)的A（m／z108.044 23，100.00%），和A＋1峰（m／z109.047 53，4.12%），而無明顯的 A＋2峰，示于圖6。

圖5 在isolation width＝6u下磺胺對甲氧嘧啶子離子 m／z 156.011 34的同位素豐度信息Fig.5 Tandem mass isotope pattern acquired of sulfameter（m／z 156.011 34）under isolation width＝6u

圖6 在isolation width＝6u下磺胺對甲氧嘧啶子離子 m／z 108.044 23的同位素豐度信息Fig.6 Tandem mass isotope pattern acquired of sulfameter（m／z 108.044 23）under isolation width＝6u

3 結(jié)論

本研究通過擴(kuò)大isolation width進(jìn)行多級質(zhì)譜試驗(yàn)，得到磺胺甲基嘧啶的子離子同位素信息，根據(jù)子離子同位素豐度比和峰形產(chǎn)生的原理，分析子離子的分子組成，為磺胺類化合物的裂解機(jī)理提供了更豐富和準(zhǔn)確的依據(jù)。在多級質(zhì)譜試驗(yàn)中關(guān)注同位素豐度和峰形信息，可以快速排除絕大多數(shù)假陽性待選分子式，使結(jié)構(gòu)解析更加快捷準(zhǔn)確。

致謝：感謝北京綠綿科技有限公司李斌工程師為本研究進(jìn)行數(shù)據(jù)處理工作。

［1］ 張鴻偉，簡慧敏，林黎明，等.液相色譜－四極桿／離子阱質(zhì)譜快速測定蜂蜜中痕量硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留［J］.分析測試學(xué)報，2012，31（7）：763－770.ZHANG Hongwei，JIAN Yuimin，LIN Liming，et al.Rapid detection of trace amounts of nitroimidazoles and their metabolites in honey using liquid chromatography coupled with quadrupole／linear ion trap mass spectrometry［J］.J Instrum Anal，2012，31（7）：763－770（in Chinese）.

［2］ 凌 睿，胡文彥，喬 玲，等.高分辨快速液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定肉制品中的剛果紅［J］.分析測試學(xué)報，2012，31（6）：730－733.LING Rui，HU Wenliao，QIAO Lin，et al.Determination of Congo red in meat products by rapid resolution liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.J Instrum Anal，2012，31（6）：730－733（in Chinese）.

［3］ LIU X，ZHOU Y，CHEN H B，et al.Detection of carbonyl groups in triterpenoids by hydroxylamine hydrochloride derivatization using electrospray ionization mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（12）：1 981－1 992.

［4］ LIU X，LI S L，ZHOU Y，et al.Characterization of protostane triterpenoids in Alisma orientalis by ultra－performance liquid chromatography coupled with quadrupole time－of－flight mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24（11）：1 514－1 522.

［5］ PLUSKAL T，UEHARA T，YANAGIDA M，et al.Highly accurate chemical formula prediction tool utilizing high－resolution mass spectra， MS／MS fragmentation，heuristic rules，and isotope pattern matching［J］.Anal Chem，2012，84（10）：4 396－4 403.

［6］ ERVE J C L，GU M，WANG Y D，et al.Spectral accuracy of molecular ions in an LTQ／Orbitrap mass spectrometer and implications for elemental composition determination［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2009，20（11）：2 058－2 069.

［7］ ALON T，AMIRAV A.Isotope abundance analysis methods and software for improved sample i－dentification with supersonic gas chromatography／mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20（17）：2 579－2 588.

［8］ KIND T，F(xiàn)IEHN O.Seven golden rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by accurate mass spectrometry［J］.Bmc Bioinformatics，2007，8：105.

［9］ KIND T，F(xiàn)IEHN O.Metabolomic database annotations via query of elemental compositions：Mass accuracy is insufficient even at less than 1ppm［J］.Bmc Bioinformatics，2006，7：234.

［10］ 周 圍，李衛(wèi)建.Massworks結(jié)合單位分辨質(zhì)譜識別喹諾酮類藥物分子式［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2009，30（增刊）：126－128.ZHOU Wei，LI Weijian.Identification quinolones drug’formulas by MassWorks combination of unit－resolved mass spectrometry［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2009，30（Suppl）：126－128（in Chinese）.

［11］ BOCKER S，LETZEL M C，LIPTAK Z，et al.SIRIUS：Decomposing isotope patterns for metabolite identification［J］.Bioinformatics，2009，25（2）：218－224.

［12］ ZHU P J，TONG W，ALTON K，et al.An accurate－mass－based spectral－averaging isotope－pattern－filtering algorithm for extraction of drug metabolites possessing a distinct isotope pattern from LC－MS data［J］.Anal Chem，2009，81（14）：5 910－5 917.

［13］ GU M，WANG Y D，ZHAO X G，et al.Accurate mass filtering of ion chromatograms for metabolite identification using a unit mass resolution liquid chromatography／mass spectrometry system［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20（5）：764－770.

［14］ CHEN J P，GU M，WANG Y D，et al.Improving the confidence of unknown compound identification by first responder mobile GC－MS laboratories in time－critical environmental and homeland security incidents［J］.LC－GC North America，2008，26（9）：938－945.

［15］ 李雪生，李子昂，王正全，等.精確質(zhì)量數(shù)在單四極桿質(zhì)譜定性分析農(nóng)藥中的應(yīng)用［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2010，31（12）：2 383－2 389.LI Xuesheng，LI Zi’ang，WANG Zhengquan.Application of accurate mass and elemental composition determination for pesticides identification using a unit mass resolution gas chromatography／mass spectrometry［J］.Chemical Journal of Chinese Universities，2010，31（12）：2 383－2 389（in Chinese）.

［16］ JIANG W，ERVE J C L.Spectral accuracy of a new hybrid quadrupole time－of－flight mass spectrometer：Application to ranking small molecule elemental compositions［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2012，26（9）：1 014－1 022.

［17］ 張 喆，李衛(wèi)建，袁有榮.使用 MassWorks快速篩查藥品中非法添加物［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2010，31（增刊）：224－226.ZHANG Zhe，LI Weijian，YUAN Yourong.Rapid identification of chemical drug mixed illegally by MassWorks［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2010，31（Suppl）：224－226（in Chinese）.

［18］ 周 圍，張雅珩，周小平.中國苦水玫瑰精油中部分天然產(chǎn)物的質(zhì)譜分析與元素組成的確定［J］.檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2010，20（5）：226－233.ZHOU Wei，ZHANG Yaheng，ZHOU Xiaoping.Mass spectrum ananlysis and elemental composition of partial natural products in essential oil of Chinese Kushui rose［J］.Journal of inspection and quarantine，2010，20（5）：226－233 （in Chinese）.

［19］ ALON T，AMIRAV A.Isotope abundance analysis for improved sample identification with tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23（23）：3 668－3 672.

［20］ 劉 可，馬 彬，王永東，等.一種新軟件方法用于單位分辨質(zhì)譜儀上藥物相對分子質(zhì)量的準(zhǔn)確測定［J］.藥學(xué)學(xué)報，2007，42（10）：1 112－1 114.LIU Ke，MA Bin，WANG Yongdong，et al.A new soft ware method for accurate mass measurements of drugs on unit mass resolution mass spectrometer［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2007，42（10）：1 112－1 114（in Chinese）.

［21］ WANG Y D，GU M.The concept of spectral accuracy for MS［J］.Anal Chem，2010，82（17）：7 055－7 062.

［22］ KLAGKOU K，PULLEN F，HARRISON M，et al.Fragmentation pathways of sulphonamides under electrospray tandem mass spectrometric conditions［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2003，17（21）：2 373－2 379.

［23］ 彭 濤.電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜裂解規(guī)律及其在殘留分析中的應(yīng)用研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.