氣相色譜－負化學電離－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測痕量氟蟲腈及代謝物的漂移對池塘水和蝦體的影響

陳珊珊，丁 丞，郭立新，馬曉東，林 燕

（中國農(nóng)業(yè)大學理學院，北京 100193）

氟 蟲 腈 （fipronil），商 品 名 為 銳 勁 特 （regent），化學名稱為（RS）－5－氨基－1－（2，6－二氯－4a－三氟甲基苯基）－4－三氟甲基亞磺?；吝颍?－腈，是拜耳作物科學公司（原羅納普朗克農(nóng)化公司）于1987年開發(fā)研制的苯基吡唑類新型廣譜殺蟲劑。氟蟲腈及其主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式示于圖1。大量試驗數(shù)據(jù)和生產(chǎn)實踐表明，氟蟲腈具有高效、低毒、殺蟲譜廣等優(yōu)點。然而，氟蟲腈及其代謝物對許多水生生物毒性高［1］，尤其是甲殼類動物，如蝦、蟹的96h致死中濃度（LC50）僅為1.0～8.6μg／L［2］，因此對環(huán)境生態(tài)和養(yǎng)殖業(yè)造成極大的威脅。此外，氟蟲腈水解半衰期長達135d，脂溶性強，易在水生生物中富集。我國南方水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘多被農(nóng)田環(huán)繞，農(nóng)田施藥時極微量的氟蟲腈漂移入水體后經(jīng)魚蝦富集會影響水產(chǎn)品質(zhì)量，甚至造成蝦、蟹死亡［3］。因此需要靈敏度高、選擇性強的分析方法監(jiān)測水環(huán)境及水生生物中超痕量氟蟲腈及其代謝物。

圖1 氟蟲腈及其主要代謝產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of the fipronil and its metabolites

目前，一般采用 GC／ECD、LC／MS、GC／MS（EI）等方法測定環(huán)境或生物樣品中氟蟲腈及其代謝物殘留量，檢測限為0.3～10μg／kg［4－20］，該靈敏度不能滿足痕量氟蟲腈及其主要代謝物測定的要求。例如，雖然GC／ECD對含有多個氟原子的氟蟲腈及其代謝物標準品靈敏度很高，但是因為環(huán)境樣品中大量含氧、硫等雜原子的干擾物使其信噪比降低，LC／MS、GC／MS（EI）方法也無法檢出極低含量的氟蟲腈。

本研究采用氣相色譜－負化學電離－質(zhì)譜（GC－NCI／MS）聯(lián)用法解決水和蝦體樣品中基質(zhì)的干 擾 問 題［20］，使 氟 蟲 腈 及 其 代 謝 產(chǎn) 物MB46513、MB45950、MB46136的檢出限大為降低，以滿足氟蟲腈環(huán)境風險評估的需求。并用此方法確證蝦富集漂移到養(yǎng)殖池塘中痕量氟蟲腈死亡的現(xiàn)象，為農(nóng)藥安全使用及管理提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氟蟲腈及其代謝物 MB46513、MB45950、MB46136農(nóng)藥標準品：德國拜耳作物科學公司產(chǎn)品；丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：北京化工廠產(chǎn)品；環(huán)己烷（色譜純）：美國Acros Organics公司產(chǎn)品；石墨化炭黑SPE柱（150～200目，0.3g）、復合SPE柱（60～100目弗羅里硅土0.5g、石墨化炭黑0.3g）：實驗室自制，使用前用10mL二氯甲烷預淋洗；純水（R≥18MΩ）：實驗室自制。

均質(zhì)機：廣州IKA Works公司產(chǎn)品；Vortex－5渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；Sigma 2－5離心機：德國Sigma公司產(chǎn)品；RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HGC－12氮吹儀：恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Perkin－Elmer Clarus 600GC／MS氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Perkin－Elmer公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 水樣的制備 水樣過濾除去水草等雜物后，取200.0mL于500mL分液漏斗中，加入5g NaCl，分別用50、40、40mL二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷萃取液，濃縮近干。將濃縮后的樣品轉(zhuǎn)移至石墨化炭黑SPE柱上，用15 mL二氯甲烷淋洗，收集淋洗液于30℃濃縮近干，N2吹干后，用環(huán)己烷定容至1mL，待進樣。

1.2.2 蝦樣的制備 準確稱取5.0g蝦樣于100mL離心管中，加入5g氯化鈉，用140mLV（丙酮）∶V（二氯甲烷）＝3∶4的溶液分2次提取，每次以10 000r／min均質(zhì)1min，3 000 r／min離心后，將全部提取液轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗中，加入15mL 0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），振搖后，靜置分層除去蛋白質(zhì)；將上層提取液經(jīng)無水硫酸鈉除水后濃縮近干，濃縮后的樣品用50mL正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至500mL分液漏斗中，用40mL乙腈萃取3次，收集乙腈萃取液，濃縮蒸發(fā)近干；再用5mL二氯甲烷溶解樣品，并全部轉(zhuǎn)入到復合SPE柱中，繼而用20 mL二氯甲烷淋洗，收集全部25mL二氯甲烷溶液，濃縮蒸發(fā)近干，N2吹干后，用環(huán)己烷定容至1mL，待測定。

1.2.3 色譜條件 載氣 （氦氣）流速：1 mL／min；色譜柱：DB－5（30m×0.25mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度60℃，以25.0℃／min升至220℃，再以10.0℃／min升至260℃，保持4min，以20.0℃／min升至270℃，保持10min；不分流進樣，進樣量1μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 檢測方法1（NCI）：傳輸線溫度250℃；源溫220℃；負化學電離，反應氣為甲烷，選擇離子檢測，氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜掃描參數(shù)列于表1。

檢測方法2（EI，用于靈敏度比較）：傳輸線溫度250℃；源溫200℃；選擇離子檢測，氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜掃描參數(shù)列于表2。

表1 氟蟲腈及其代謝物的GC－MS／NCI／SIM選擇離子Table 1 Representative ions for fipronil and its metabolites in GC－MS／NCI／SIM quantification

表2 氟蟲腈及其代謝物的GC－MS／EI／SIM選擇離子Table 2 Representative ions for fipronil and metabolites in GC－MS／EI／SIM quantification

1.2.5 標準曲線的建立 分別提取空白水樣或空白蝦樣，用提取液配制基質(zhì)標準液，水樣基質(zhì)標準液系列濃度為 2、5、10、25、50、100、200 μg／L，蝦樣基質(zhì)標準液系列濃度為1、2、5、10、25、50μg／L，用GC－MS（NCI／SIM）檢測，建立標準曲線。

1.2.6 添加回收率的測定 取200.0mL空白水樣或5g空白蝦樣添加工作標準溶液，水樣中添加濃度為0.01μg／L和1μg／L，蝦樣中添加濃度為0.4μg／kg和2μg／kg。按照上述方法分析檢測，重復5次，計算方法的回收率和相對標準偏差。

1.2.7 樣品的測定 樣品采自浙江平湖一養(yǎng)殖場中的池塘水和蝦，樣品按照1.2.1和1.2.2進行前處理，按照1.2.3和1.2.4進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC－MS／NCI／SIM 和 GC－MS／EI／SIM 方法的比較

分別用 GC－MS／NCI／SIM 和 GC－MS／EI／SIM方法分析濃度為20μg／L氟蟲腈及其代謝物標準品。采用EI測定時，除MB46513外，其它組分勉強出峰，示于圖2。采用NCI測定時，各組分的峰型良好，信噪比分別是MB46513為44 270，MB45950為8 156，氟蟲腈為10 045，MB46136為50 249，示于圖3。由于含有多個鹵原子，氟蟲腈及其代謝物的電負性極強，適用于NCI測定，同時樣品溶劑和儀器本底中氧、硫等雜原子響應值低，由此提高了信噪比。這種選擇性在基質(zhì)干擾強的水樣和蝦樣中更明顯，故選擇NCI電離方式。

在農(nóng)藥暴露量分析中，一般選擇數(shù)個特征離子檢測目標化合物。氟蟲腈及其代謝物含2個氯原子，質(zhì)譜圖中可見含氯原子的同位素離子簇。如含1個氯原子的同位素離子簇：m／z384和386、m／z352和354，其豐度比均為3∶1；含2個氯原子的同位素離子簇：m／z366和368、m／z383和385，豐度比均為9∶6。這些含氯碎片的離子對作為檢測所用的特征離子，其質(zhì)荷比及豐度比結(jié)合色譜保留時間，對于鑒定氟蟲腈及其代謝物有重要意義。

圖2 氟蟲腈及其代謝物GC－MS／EI／SIM色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.2 GC－MS／EI／SIM chromatograms and mass spectrogram of fipronil and its metabolites

2.2 標準曲線的建立

選擇豐度高且無干擾的離子作為定量離子。由于氟蟲腈及其代謝物具有明顯的基質(zhì)效應，在水樣和蝦樣的檢測中用基質(zhì)標準曲線定量，其線性方程列于表3。氟蟲腈及其代謝物的水樣基質(zhì)標準曲線在2～200μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；蝦樣基質(zhì)標準曲線在1～50μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 準確度和精密度

向空白水樣和蝦樣中添加氟蟲腈及其代謝物標準品，添加水平分別為0.01、1μg／L（水）和0.4、2μg／kg（蝦），用該方法分析，實驗重復5次。在如此低的濃度下，各組分添加回收率在78%～120%之間，相對標準偏差小于15%，結(jié)果列于表4。實驗結(jié)果說明，該方法的準確度和精密度符合暴露量檢測要求。

圖3 氟蟲腈及其代謝物GC－MS／NCI／SIM色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.3 GC－MS／NCI／SIM chromatograms and mass spectrogram of fipronil and its metabolites

表3 氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)標準曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Liner regression equation and correlation coefficients of fipronil and its metabolites

表4 氟蟲腈及其代謝物的加標回收率Table 4 Recovery of fipronil and its metabolites in spiked water pond and shrimp sample

與文獻報道的分析方法中涉及的樣品基質(zhì)相比，蝦塘水及蝦基質(zhì)比較特殊。蝦塘水中會有較多的水草及藻類，樣品用二氯甲烷提取后，再用石墨化炭黑去除水藻色素。蝦樣采用的提取劑為V（丙酮）∶V（二氯甲烷）＝3∶4的溶液，用磷酸鹽緩沖液去除蛋白，然后用正己烷－乙腈溶劑除去大部分油脂，殘存的油脂和色素等雜質(zhì)用復合SPE柱除去。以上樣品凈化方法結(jié)合負化學電離選擇離子檢測，提高了方法的選擇性和靈敏度；氟蟲腈及其代謝物在水中的檢測限為0.01μg／L，在蝦中的檢測限為0.4μg／kg。

2.4 樣品測定

在浙江平湖地區(qū)稻田噴施氟蟲腈10天后，在距離稻田50m外的蝦塘中發(fā)現(xiàn)了病蝦和死蝦，用所建立的方法檢測其中的藥劑及其代謝物的暴露量，結(jié)果列于表5。

表5 氟蟲腈及其代謝物在蝦塘水及蝦中的暴露量Table 5 The residual of fipronil and its metabolites in water pond and shrimp

由于 GC－MS／NCI／SIM 靈敏度高、選擇性好，即使噴施氟蟲腈10天后，在距稻田50m外的蝦塘水體及蝦中均能檢出痕量氟蟲腈及其代謝物。其中 MB46513在水中檢出0.01～0.02 μg／L，在蝦中檢出7.2～12.2μg／kg；MB45950在水中的檢出小于0.01～0.01μg／L，在蝦中檢出3.0～3.2μg／kg；氟蟲腈在水中檢出0.01～0.09μg／L，在 蝦 中 檢 出 4.5～5.2μg／kg；MB46136在水中檢出0.01～0.02μg／L，在蝦中檢出26.3～50.5μg／kg。

參 考 OECD（Organization for Economic Co－operation and Development）關(guān)于生物富集系數(shù)的計算方法，采用池塘水中氟蟲腈及其代謝物總暴露量的平均值作為水中農(nóng)藥的濃度值，對蝦樣品進行富集倍數(shù)（BCF）值的計算，結(jié)果列于表6。

式中：BCF為生物富集系數(shù)；Cfs為蝦體內(nèi)的農(nóng)藥暴露量（μg／kg）；Cws為水體中的農(nóng)藥暴露量（μg／L）。

表6 氟蟲腈及其代謝物在蝦體內(nèi)的富集倍數(shù)Table 6 The BCF10dof fipronil and its metabolites in shrimp

蝦樣品中，S－1～S－3為蝦塘中死蝦，S－4～S－6為活蝦。從實驗結(jié)果可以看出，樣品S－1～S－3中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的暴露量均高于樣品S－4～S－6。從BCF值的計算結(jié)果可以看出，死蝦的BCF值為1 293～1 164，活蝦的BCF值為909～745。通過實驗發(fā)現(xiàn)，雖然養(yǎng)殖塘中水體與稻田并不連通，但稻田噴藥時漂移到水塘中痕量的氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物在蝦體中富集，經(jīng)過一段時間后使蝦的抵抗力減弱，從而生病并死亡。

3 結(jié)論

建立了氣相色譜－負化學電離－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測水樣和蝦樣中氟蟲腈及其3種主要代謝物，該方法的準確度、精密度及靈敏度均達到了環(huán)境風險評價和農(nóng)藥暴露量分析的要求。應用該方法對實際樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈及其主要代謝產(chǎn)物的總量在蝦體中的富集系數(shù)高達1 040。

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