高密度脂蛋白亞組分促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能研究*

譚迎，田迪，劉挺榕，賴文巖，郭志剛

高密度脂蛋白(HDL)是一個復(fù)雜的多功能蛋白復(fù)合體，可通過其促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運、抗炎、抗氧化及抗血栓形成等多種功能發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，其中，促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能最為關(guān)鍵。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，在急性期反應(yīng)、慢性炎癥以及一些代謝性疾病中，HDL的抗動脈粥樣硬化減弱，甚至出現(xiàn)致動脈粥樣硬化作用［1-3］。Shao 等［4］研究證實，氧化損傷可損害HDL主要組成蛋白載脂蛋白A-I(apoA-I)促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能，其機制可能與HDL發(fā)生氧化修飾有關(guān)。Heinecke等［5］發(fā)現(xiàn)從冠心病患者血漿分離出的HDL中髓過氧化物酶的兩種產(chǎn)物(氯酪氨酸和硝基酪氨酸)均明顯升高，推測冠心病患者HDL抗氧化功能可能受到了損害。急性冠狀動脈(冠脈)綜合征(ACS)發(fā)生時，機體處于一種特殊的炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此我們推測ACS的發(fā)生可能損害HDL膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能，從而使HDL抗動脈粥樣硬化作用減弱甚至出現(xiàn)致動脈粥樣硬化作用。HDL亞組分主要由HDL2和HDL3組成，目前國內(nèi)外關(guān)于HDL2和HDL3抗動脈粥樣硬化作用的強弱仍存在許多爭議。為此，本研究通過檢測健康人群及ACS患者HDL亞組分介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)出率及脂氫過氧化物(LOOH)水平，以明確ACS患者HDL亞組分促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能是否受到了損害，同時探討HDL2和HDL3抗AS作用的強弱。

1 對象和方法

研究對象:2011-01至2012-01選取我院心內(nèi)科住院的ACS患者(ACS組)40例，男27例，女13例，平均年齡(51.5±6.2)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)確診的ACS患者應(yīng)符合不穩(wěn)定性心絞痛臨床表現(xiàn)、冠狀動脈(冠脈)造影示至少有一支血管狹窄＞50%、心肌酶譜及肌鈣蛋白升高和/或心電圖有動態(tài)改變。排除標(biāo)準(zhǔn):高血壓未控制平穩(wěn)、糖尿病、肝腎功能異常、甲狀腺功能異常、腫瘤、自身免疫性疾病、任何急性或慢性炎癥性疾病、甘油三酯≥5mmol/L及體重指數(shù)(BMI)≥30 kg/m2者、近6周內(nèi)服用調(diào)脂藥物者。我院同期健康體檢者(對照組)40例，男27例，女13例，平均年齡(49.2±5.0)歲，無冠心病及高脂血癥病史，除外高血壓、糖尿病、肝腎功能異常、甲狀腺功能異常、腫瘤、自身免疫性疾病、任何急性或慢性炎癥性疾病及血脂代謝異常相關(guān)疾病者。本研究已通過倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選者均為自愿參加本研究并簽署知情同意書。

血脂及高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)檢測:抽取兩組人群清晨空腹靜脈血5ml，靜置30 min后離心取血清，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶學(xué)終點比色法在全自動生化分析儀上檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度;采用透射比濁法檢測血清高敏C-反應(yīng)蛋白濃度。

高密度脂蛋白亞組分(HDL2和HDL3)分離提取:采用Karlsson等［6］兩步非連續(xù)性超高速密度梯度離心方法分離提取HDL亞組分。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血20ml，離心后收集血漿并加入乙二胺四乙酸(1mg/ml)和蔗糖(終濃度0.5%)以防HDL氧化和凝集。用固體溴化鉀(0.3816 g/ml)調(diào)整血漿(取4ml)密度至1.24 g/ml，置于規(guī)格為8.9ml離心管底部，上緩慢加入溴化鉀/磷酸鹽緩沖液(0.0834 g/ml，密度1.063 g/ml)，用考馬斯亮藍(lán)著色蛋白(此試管作為分離收集HDL的參考)。配平后置于超高速離心機(Beckman L-80 XP，Ti90轉(zhuǎn)子，固定轉(zhuǎn)角，購自美國基因儀器公司)中以290000 g于15℃離心4 h，離心后離心管上層為及低密度脂蛋白和低密度脂蛋白，中層為HDL2和HDL3。用注射器穿刺離心管分別抽取HDL2和HDL3，置兩離心管中，再于其上分別緩慢加入溴化鉀/PBS溶液(0.3816 g/ml，密度至 1.24 g/ml)，290000 g于15℃離心2 h后，HDL2和HDL3均漂浮于離心管上層，分別收集上層液體。將兩種液體分別在含200 μmol/L乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖液中透析48 h，超濾除菌，4℃保存。

高密度脂蛋白亞組分介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氚三膽固醇轉(zhuǎn)出率檢測［7］:將J774巨噬細(xì)胞(美國，American Type Culture Collection公司)接種在24孔培養(yǎng)板上(細(xì)胞濃度2×105/ml)，以 DMEM 培養(yǎng)液(含 0.2%BSA)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)液中加入氚三膽固醇(終濃度1μCi/mL;美國PerkinElmer公司)及促進(jìn)細(xì)胞吸收膽固醇的氧化低密度脂蛋白(終濃度30 μg/ml)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌2次后，再次加入DMEM全培養(yǎng)液(含0.2%BSA)及8-溴-磷酸腺苷(8-Br-cAMP終濃度0.3mmol/L)培養(yǎng)12 h后去培養(yǎng)液。以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌1次，再次加入DMEM全培養(yǎng)液(含0.2%BSA)，同時加入待測的 HDL2或 HDL3(50 μg/ml)，4 h后收集培養(yǎng)液并用0.45 μm玻璃纖維過濾器過濾后移出細(xì)胞碎片，細(xì)胞用磷酸鹽平衡鹽溶液洗滌并用1ml氫氧化鈉(0.1 mol/L)完全溶解。最后利用液閃計數(shù)儀檢測細(xì)胞溶解物及細(xì)胞介質(zhì)的氚三放射量。氚三膽固醇轉(zhuǎn)出率用細(xì)胞介質(zhì)中氚三膽固醇放射量占總放射量(細(xì)胞內(nèi)+細(xì)胞介質(zhì))的百分比表示。

高密度脂蛋白亞組分(HDL2和HDL3)脂氫過氧化物(LOOH)含量檢測［8］:采用二甲苯酚橙顯色實驗法檢測。取 HDL2或 HDL3溶液 90 μl，加 10 μl硫胺素焦磷酸(10mmol/L)或甲醇混勻，37℃反應(yīng)30 min;加入 FOX 反應(yīng)液(250 μmol/L 硫酸亞鐵、100 μmol/L二甲酚橙、25mmol/L H2SO4、4mmol/L 2，6-二叔丁基對甲酚，溶于90%甲醇中)900 μl，混勻，室溫反應(yīng)30 min;室溫下12000 g離心5 min。取上清液測D560 nm值，以加與不加硫胺素焦磷酸兩管的D 560 nm值之差計算LOOH含量。

統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。檢驗各組變量正態(tài)分布情況，非正態(tài)分布的變量經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后使之正態(tài)化后再分析;采用F檢驗進(jìn)行方差齊性檢驗，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組基本臨床資料比較:與對照組比較，ACS組血清LDL-C水平及高敏C-反應(yīng)蛋白濃度均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05～0.001);兩組年齡、總膽固醇、甘油三酯及HDL-C水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表1

表1 兩組基本臨床資料比較()

表1 兩組基本臨床資料比較()

注:與對照組比較*P=0.004 ＊＊P＜0.001

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兩組HDL亞組分(HDL2和HDL3)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氚三膽固醇轉(zhuǎn)出率比較:ACS組HDL2、HDL3介導(dǎo)的氚三膽固醇轉(zhuǎn)出率均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.001)。表2

表2 兩組HDL亞組分HDL2和HDL3促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能比較()

表2 兩組HDL亞組分HDL2和HDL3促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能比較()

注:與對照組比較*P＜0.001;與同組內(nèi) HDL2比較△P＜0.05△△P＜0.001 ACS:急性冠脈綜合征;LOOH:脂氫過氧化物;HDL:高密度脂蛋白

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兩組HDL亞組分(HDL2和HDL3)LOOH水平比較:與對照組相比，ACS組HDL亞組分的HDL2-LOOH及HDL3-LOOH水平均升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.001)。表2

兩組同組內(nèi)HDL亞組分HDL2和HDL3功能比較:對照組及ACS組的HDL3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氚三膽固醇轉(zhuǎn)出率均較HDL2明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);對照組及ACS組的HDL亞組分HDL3-LOOH水平則均較HDL2-LOOH明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05～0.001)。表2

3 討論

近年來，大量研究證實HDL功能較高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平更能預(yù)測動脈粥樣硬化及冠心病發(fā)生風(fēng)險，其中HDL介導(dǎo)的逆膽固醇轉(zhuǎn)運功能尤為重要。2011年Khera等［9］在新英格蘭雜志上發(fā)表的文章顯示:HDL-C與頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)之間無明顯相關(guān)關(guān)系，而HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)出率與頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)和冠心病發(fā)生風(fēng)險呈高度負(fù)相關(guān)，此相關(guān)關(guān)系獨立于 HDL-C水平，表明HDL介導(dǎo)的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能可獨立于HDL-C水平更好地預(yù)測AS及冠心病發(fā)生風(fēng)險。本研究兩組人群HDL-C水平無統(tǒng)計學(xué)差異，但ACS組患者促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能較正常對照組明顯下降(P＜0.001)，直接表明了HDL-C水平并不能完全代表HDL功能，進(jìn)一步確證了HDL促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能可獨立于HDLC水平更好地預(yù)測AS發(fā)生風(fēng)險。結(jié)構(gòu)決定功能，對HDL亞組分結(jié)構(gòu)及改善HDL功能藥物的研究有望為AS及冠心病的防治提供新的干預(yù)手段。

炎癥反應(yīng)在ACS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，本研究ACS組患者較對照組高敏C-反應(yīng)蛋白明顯升高，亦可說明［10］。嚴(yán)曉偉等［11］報道顯示，炎癥性疾病中，HDL中磷脂含量降低、載脂蛋白A-I的氧化及糖基化修飾等均可以導(dǎo)致HDL與巨噬細(xì)胞的結(jié)合減少，從而使HDL介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流受抑制。與其報道相一致，我們的研究發(fā)現(xiàn)ACS的發(fā)生可使HDL亞組分介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流受抑制，其機制可能與炎癥條件下HDL亞組分結(jié)構(gòu)重塑及組成蛋白的改變有關(guān)。

脂氫過氧化物(LOOH)是評估HDL抗氧化功能的一個重要指標(biāo)。它可通過與HDL結(jié)合氧化HDL，導(dǎo)致HDL抑制氧化型低密度脂蛋白產(chǎn)生的能力減弱，甚至使HDL出現(xiàn)促氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，在全身炎癥的條件下，HDL的結(jié)構(gòu)會被修飾，從而降低了其抗炎抗氧化功能，甚至促進(jìn)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成加重斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)［12］。本研究顯示，與對照組比較，ACS患者HDL亞組分LOOH水平明顯升高(P＜0.001)，證實ACS的發(fā)生可損害HDL亞組分的抗氧化功能，甚至可能使HDL亞組分轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写傺趸饔玫氖Чδ茴w粒加劇ACS的發(fā)展。Alwail等［10］等通過蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，急性冠脈綜合征組患者其HDL組成發(fā)生改變，蛋白載脂蛋白A-IV水平較對照組顯著減少，而血清淀粉樣蛋白A(SAA)及補體3(C3)等炎癥蛋白則較對照組明顯增加，表明ACS患者HDL中炎性蛋白的增加可能是HDL發(fā)生失功能改變的重要機制。

血漿中HDL亞組分主要以HDL2和HDL3為主，HDL3為小的、密度較大、未成熟的顆粒，HDL2為大的、密度較小、成熟的顆粒［13］。研究發(fā)現(xiàn)，HDL2較HDL3包含有更多的載脂蛋白A-I(apoA-I)，而HDL3包含有更多的載脂蛋白A-Ⅱ(apoA-Ⅱ)，且其與載脂蛋白L-I、載脂蛋白F、載脂蛋白A-IV、載脂蛋白M、載脂蛋白J、載脂蛋白D、屛氧酶1、屛氧酶3和血清淀粉樣蛋白 A(SAA)等蛋白更為相關(guān)［14，15］。大量研究證實HDL2較HDL3具有更好地心血管保護(hù)作用，但亦有一些專家認(rèn)為，二者具有同等程度的心血管保護(hù)作用［16，17］。本研究證實，HDL2較 HDL3有更強的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能，提示HDL2可能較HDL3具有更好的心血管保護(hù)作用。有報道顯示，血清淀粉樣蛋白A可選擇性損害HDL3促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能［14］，因而推測血清淀粉樣蛋白A可能是HDL亞組分功能差異的重要因素。

總之，本研究證實，ACS的發(fā)生可損害HDL亞組分的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能，這也直接表明HDL-C水平并不能完全代表HDL功能，HDL亞組分介導(dǎo)的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能可獨立于HDL-C水平更好地預(yù)測動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生風(fēng)險。同時還發(fā)現(xiàn)HDL2較HDL3具有更強的促膽固醇逆轉(zhuǎn)運及抗氧化功能，其具體機制尚未明確?？梢?，對異常HDL功能的評估及HDL亞組分的深入研究是十分必要的，有望為動脈粥樣硬化及冠心病的防治提供新的思路。此外，由于時間的限制，本研究仍存在不足之處，即缺少穩(wěn)定性心絞痛組與ACS組進(jìn)行對照，無法明確HDL亞組分功能在穩(wěn)定性心絞痛患者和ACS患者是否亦存在差異，更進(jìn)一步的深入研究有待進(jìn)行。

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