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    冠心病候選基因β2腎上腺素能受體基因相關(guān)微小核糖核酸let-7i的實驗研究

    2013-07-31 03:08:28郭威早李琳
    中國循環(huán)雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:家族陰性調(diào)控

    郭威早,李琳

    β2腎上腺素能受體基因[人類基因組織(HUGO)命名委員會(HGNC)標(biāo)準(zhǔn)全名:“adrenergic,beta-2-,receptor,surface”,HGNC 標(biāo)準(zhǔn)基因代號:ADRB2],是冠心病的重要候選基因,與重型進(jìn)行性冠心病,例如伴有急性心肌梗死的冠心病關(guān)系尤為密切[1]。該基因的蛋白產(chǎn)物屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,通過G蛋白作用介導(dǎo)兒茶酚胺誘導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶活化。在結(jié)構(gòu)方面,該基因非常特殊,同絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因不同,該基因沒有內(nèi)含子,因此該基因在表達(dá)調(diào)控方面可能具備區(qū)別于大多數(shù)基因的特點。此外,該基因的5’側(cè)翼序列中含有糖皮質(zhì)激素反應(yīng)基序(glucocorticoid response element,GRE)[2],而糖皮質(zhì)激素與應(yīng)激及心功能關(guān)系極為密切[3]。因此該基因具有GRE的結(jié)構(gòu)特點,有助于合理地解釋冠心病與應(yīng)激的密切關(guān)系[4]。微小核糖核酸(microRNA,簡稱miRNA)是生物體中內(nèi)源性的,由基因表達(dá)產(chǎn)生的RNA分子,其最終的活性形式為短鏈RNA分子,長度為22核苷酸左右,通過與相關(guān)的信使RNA結(jié)合抑制其翻譯或誘發(fā)其降解。miRNA通過基因調(diào)控,在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化以及對環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用[5]。探討miRNA調(diào)控機制與ADRB2的基因功能的關(guān)系,可以更深入地認(rèn)識ADRB2的基因調(diào)控機制,亦可以促進(jìn)對冠心病的分子病理學(xué)的認(rèn)識,為探索新的預(yù)防和治療途徑提供分子水平的新線索。

    1 資料與方法

    調(diào)節(jié)ADRB2基因候選miRNA的預(yù)測:miRNA機制是一類特殊的基因調(diào)控機制,miRNA和被調(diào)控基因之間沒有特定的、嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系,具有“一對多、多對一”的特點,復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)模式使直接的實驗驗證難度很高、成本巨大。因此,對調(diào)節(jié)特定基因的miRNA進(jìn)行預(yù)測具有重要的實用意義。基于上述原因,學(xué)界對miRNA與靶位點之間的模糊匹配關(guān)系進(jìn)行了大量深入的研究,建立了行之有效的預(yù)測模型。本研究所采用的預(yù)測方法就是依據(jù)既往研究所發(fā)現(xiàn)的一種組合策略[6],這一策略認(rèn)為,如果以下二個條件滿足,則相關(guān)miRNA和基因之間就具備調(diào)控和被調(diào)控關(guān)系:①從miRNA 5’端第一或第二堿基算起的7個連續(xù)堿基的“核”序列或“種子”序列與被調(diào)節(jié)基因3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)部分序列構(gòu)成完全Watson-Crick匹配(即符合堿基配對原則的匹配);②上述“核”序列和3’-UTR對應(yīng)序列之間可以具有不匹配的堿基,只要二者結(jié)合的自由能不增加并且不含G∶U配對。此策略簡稱為“種子區(qū)”(seed-region)預(yù)測法,按種子區(qū)法,利用美國麻省理工學(xué)院(MIT)TargetScan數(shù)據(jù)庫(2011-11第6版),對人ADRB2基因561bp(根據(jù)NCBI編號為NM_000024的參考序列)的3’-UTR進(jìn)行了候選miRNA的預(yù)測。

    心肌細(xì)胞株培養(yǎng):實驗研究于2011-09至2012-04之間進(jìn)行。大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)按照既往報道的方法[7]進(jìn)行培養(yǎng)。基本步驟為,采用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清,在5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)。一輪培養(yǎng)3天,然后按1∶4的比例分盤繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞脫壁收集采用0.25%胰蛋白酶合并0.53 mM依地酸二鈉(EDTA)溶液處理10 min。

    miRNA的增強和抑制:Pre-miR miRNA前體(增強劑)和Anti-miR miRNA抑制劑及相應(yīng)對照均從美國Ambion公司購買。根據(jù)相應(yīng)miRNA序列的隨機化紊亂(scramble)序列所合成的短鏈RNA作為陰性對照。采用美國Neuromics公司iFect轉(zhuǎn)染試劑盒,將let-7i增強劑(n=6)、抑制劑(n=6)及miRNA陰性對照(n=6)分別導(dǎo)入培養(yǎng)的H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞,具體操作按照該試劑盒說明書進(jìn)行。每種miRNA轉(zhuǎn)染劑量在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上,正式實驗劑量選擇為20 nmol/L。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后狀態(tài)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

    蛋白免疫印跡雜交:蛋白免疫印跡雜交(Western Blot)參照文獻(xiàn)報道[7]方法進(jìn)行,作了少許簡化和適應(yīng)性修改。具體步驟簡述如下,將所收集的約106心肌細(xì)胞重懸于1ml冰冷的裂解緩沖液,勻漿后通過Virtis超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲剪切,繼以14000g離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進(jìn)行。等量的蛋白加入到8% ~16%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離,然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水,0.1%吐溫-20?,5%脫脂牛奶。兔抗人 ADRB2抗體購自美國Santa-Cruz生物技術(shù)公司,該抗體除可用于人源性ADRB2蛋白的檢測,亦可以用于大鼠ADRB2蛋白的檢測。實驗中采用1∶200的比例稀釋。β-肌動蛋白抗體(美國Cell Signaling公司)用作上樣對照。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯(lián)的抗兔抗體。免疫復(fù)合物用Amersham ECL加強型試劑盒探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene凝膠建檔及分析系統(tǒng)進(jìn)行。

    統(tǒng)計分析:一元ANOVA采用SPSS 11.5版進(jìn)行。資料收集,一般統(tǒng)計計算(均值±標(biāo)準(zhǔn)差等)以及統(tǒng)計作圖采用GraphPad Prism(第4版)進(jìn)行。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    miRNA let-7家族與ADRB2基因關(guān)系:根據(jù)預(yù)測結(jié)果,約有150個 miRNA具有不同程度的調(diào)節(jié)人ADRB2基因的可能性。表1列舉了種子區(qū)完全配對的ADRB2基因候選miRNA。

    表1 種子區(qū)完全配對的β2腎上腺素能受體基因候選微小核糖核酸

    其中4個miRNA家族具有種系穩(wěn)定性(conservation)[8]:靈長類、嚙齒類等動物之間具有高度一致的同源性。該4個miRNA家族中11個miRNA成員按照種子區(qū)原理與ADRB2具有很好的匹配性,無論從5’端的第一個或第二個堿基開始,均表現(xiàn)為其后7個堿基的完全Watson-Crick配對,也就是5’端開始的8個堿基的完全配對,符合種子區(qū)挑選法的最高要求。4個 miRNA 家族為 miRNA-98、miRNA-4458、miRNA-4500和let-7,其中l(wèi)et-7家族與 ADRB2關(guān)系特別明顯,let-7家族的 8個成員,let-7a/b/c/d/e/f/g/i,都對ADRB2基因具有理論預(yù)測的調(diào)控作用。根據(jù)已知的研究資料,在let-7家族內(nèi)部,let-7i和冠心病關(guān)系密切[9],因此,被挑選作為進(jìn)一步實驗驗證對象。

    let-7i功能水平與ADRB2基因蛋白表達(dá)水平:用let-7i的Pre-miRNA前體和let-7i的Anti-miRNA分別對培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)實施轉(zhuǎn)染,然后處理48 h.let-7i的原序列為5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU-3’,采用美國麻薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的在線程序?qū)嵤┪蓙y化處理,得到的序列為5’-GAUGGGGCUUAGUUUUGUGUA-3’,作為實驗的 miRNA陰性對照。大鼠心肌細(xì)胞在增強和抑制處理后,組織形態(tài)學(xué)無明顯變化,根據(jù)倒置顯微鏡觀察計數(shù),let-7i增強劑作用的細(xì)胞計數(shù)比miRNA陰性對照高8% ~11%,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1)。

    圖1 經(jīng)let-7i Pre-miRNA前體和let-7i Anti-miRNA抑制劑處理的大鼠心肌細(xì)胞

    let-7i功能水平與ADRB2基因蛋白表達(dá)水平相關(guān)關(guān)系:使用 let-7i Pre-miRNA(增強劑)處理細(xì)胞48h后,ADRB2基因蛋白表達(dá)水平降低,以光密度(OD)所表示的蛋白水平由 miRNA陰性對照水平67.03±15.20下降至 25.59±10.53,下降了 61.83%(P=0.0012,95%可信區(qū)間:19.22~63.66);與 let-7i增強劑處理效果相反,當(dāng)使用let-7i Anti-miRNA(抑制劑)處理細(xì)胞48 h后,ADRB2基因蛋白表達(dá)水平由miRNA陰性對照水平上升至99.53±25.23,升高了48.49%(P=0.0071,95% 可 信 區(qū) 間:-54.72~-10.28),let-7i功能水平與ADRB2基因蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,見圖2。

    圖2 let-7i增強劑和let-7i抑制劑對ADRB2蛋白質(zhì)水平的影響。大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)分別以let-7i增強劑和let-7i抑制劑轉(zhuǎn)染處理48 h,ADRB2蛋白水平以免疫印跡雜交確定。圖中蛋白水平為miRNA陰性對照水平的百分比(miRNA陰性對照水平設(shè)定為100%),β-肌動蛋白(ACTB)抗體作為電泳上樣內(nèi)參照。圖示的數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差,每組6個樣本(n=6),與miRNA陰性對照比較**P<0.01,統(tǒng)計檢驗采用方差分析

    3 討論

    冠心病作為復(fù)雜性疾病,其發(fā)病機制尚無定論,但一般認(rèn)為是遺傳易感性和環(huán)境相互作用的結(jié)果[10]。在遺傳易感性方面,研究主要聚焦于一些與冠心病發(fā)病密切相關(guān)的候選基因方面,例如ADRB2;在環(huán)境方面,應(yīng)激因素歷來是被關(guān)注的重點[11]。miRNA與上述二個方面都有極為密切的關(guān)系。首先,miRNA是近年來才發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控的重要機制,miRNA以特定的方式在轉(zhuǎn)錄后和翻譯前調(diào)節(jié)眾多基因的表達(dá)水平。此外,miRNA是機體應(yīng)激反應(yīng)中最重要的基因調(diào)控機制之一[12]。將上述二個方面聯(lián)系起來,miRNA和冠心病之間存在聯(lián)系具有極高的可能性。

    本研究以冠心病一個重要候選基因ADRB2為基礎(chǔ),預(yù)測了可能調(diào)節(jié)該基因的miRNA。在調(diào)節(jié)ADRB2的多個miRNA家族中,let-7家族值得特別關(guān)注。首先,let-7家族具有廣泛的種系穩(wěn)定性或稱為保守性,說明其在基因調(diào)控中具有基礎(chǔ)級的重要作用。另外,本文作者自己和其他研究者的工作均提示,let-7家族與心血管病關(guān)系密切。第一點表現(xiàn)在間接關(guān)系方面。Let-7家族對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的上游信號分子RAS通過多位點結(jié)合發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,此點已被研究證實[13]。另外,在let-7家族成員中非常值得關(guān)注的是,日本巖手醫(yī)科大學(xué)佐藤衛(wèi)等的研究提示[8],let-7i和冠心病具有直接的關(guān)聯(lián)。用于冠心病預(yù)防和治療的降脂藥阿托伐他汀的一部分治療作用就是通過調(diào)節(jié)let-7i實現(xiàn)的。因此,let-7i被挑選進(jìn)行了實驗驗證。實驗驗證的結(jié)果和理論預(yù)計完全一致,let-7i的功能水平和ADRB2基因的蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。由此進(jìn)一步證實了let-7家族對ADRB2基因存在調(diào)控作用的預(yù)測。此外,其它候選miRNA也值得關(guān)注,例如 miR-98與血管損傷有關(guān)[14],此外更值得關(guān)注的是,在血管加壓素-Ⅱ所誘導(dǎo)的心肌肥厚中,miRNA-98和let-7的變化表現(xiàn)出聯(lián)動性[15]。

    目前的研究是基于心肌細(xì)胞的分子生物學(xué)研究,進(jìn)一步采用實驗動物的在體研究以及采用臨床病例的應(yīng)用研究是值得深入的研究方向。

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