擴(kuò)張型心肌病蛋白質(zhì)組學(xué)研究

于麗平，史琳影，朱曉明，蔡軍，楊新春，孟憲敏

擴(kuò)張型心肌病蛋白質(zhì)組學(xué)研究

于麗平，史琳影*，朱曉明，蔡軍，楊新春，孟憲敏△

目的:通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較擴(kuò)張型心肌病(DCM)患者和正常人心肌組織差異蛋白質(zhì)譜，找出與DCM相關(guān)的差異蛋白，進(jìn)一步探討DCM發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。

方法:選擇9例原發(fā)病為DCM、左心室射血分?jǐn)?shù)＜35%且接受心臟移植手術(shù)的患者作為DCM組:心肌組織取自患者自有心臟的左心室游離壁。對照組:心肌組織取自6例不能用作移植的供體心臟。采用雙向凝膠電泳(2-DE)分析蛋白質(zhì)譜差異，熱考馬斯亮藍(lán)染色，串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)鑒定差異蛋白。采用生物醫(yī)學(xué)研發(fā)軟件及資料庫Ingenuity Pathways Analysis分析差異蛋白的定位、功能和相互作用。

結(jié)果:DCM組和對照組心肌組織2-DE圖像中蛋白點(diǎn)的整體分布比較相似，可以檢測到超過1 000個(gè)蛋白點(diǎn)。通過比較分析，共鑒定出25種差異蛋白，其中在DCM組15種上調(diào)，10種下調(diào)。使用LOCATE數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白的亞細(xì)胞定位，提示其中大分子蛋白占40%，細(xì)胞骨架蛋白為28%，線粒體蛋白為28%。蛋白的PANTHER分類顯示大多數(shù)差異蛋白參與了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、肌肉收縮、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和水解酶的活性等功能。生物學(xué)途徑分類揭示差異蛋白參與了組織的形成過程、生物調(diào)節(jié)、發(fā)育過程、代謝過程和對刺激的應(yīng)答過程等。

結(jié)論:對DCM患者心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)25種差異蛋白，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白有15種，下調(diào)表達(dá)的有10種;這些蛋白參與了線粒體能量代謝、心肌收縮、凋亡等過程;提示這些過程可能在DCM發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

擴(kuò)張性心肌病;蛋白質(zhì)組學(xué);能量代謝

(Chinese Circulation Journal，2013，28:47.)

原因不明的擴(kuò)張型心肌病(DCM)是一種以左心室、右心室或雙側(cè)心腔擴(kuò)大、心臟收縮功能障礙為主要特征的心肌疾病，其臨床表現(xiàn)以進(jìn)行性心力衰竭、心律失常、血栓栓塞甚或猝死為基本特征。近年來，DCM發(fā)病呈上升趨勢［1］，我國 DCM 發(fā)病率為19/10萬［2］，預(yù)后極差。國外曾報(bào)道5年病死率約15.0%～50.0%［3］，國內(nèi)報(bào)道2年病死率為41.2%、5年病死率為80.0%。但DCM的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)(如表達(dá)水平、翻譯后修飾、相互作用等)為基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)水平上對疾病機(jī)理、細(xì)胞模式、功能聯(lián)系等方面進(jìn)行研究和探索的科學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)在DCM研究領(lǐng)域中的應(yīng)用也取得了一定進(jìn)展，但上述研究主要針對DCM動(dòng)物模型心肌組織蛋白質(zhì)譜改變［4］，而側(cè)重于DCM患者心肌組織蛋白質(zhì)譜的研究相對較少。雙向凝膠電泳(2-DE)-質(zhì)譜(MS)-生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典技術(shù)路線［5］，主要依據(jù)蛋白質(zhì)兩個(gè)相互獨(dú)立的特性等電點(diǎn)和分子量對蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離。該技術(shù)具有直觀、快捷、高通量等特點(diǎn)。能檢測出更多真實(shí)的差異表達(dá)，鑒別出最小的差異［6］。因此，本研究擬采用2-DE技術(shù)比較DCM患者和供體心肌組織差異蛋白質(zhì)譜，找出DCM相關(guān)的差異蛋白，進(jìn)一步探討DCM發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 資料和方法

對象:標(biāo)本從阜外醫(yī)院外科心臟移植中篩選9例原發(fā)病為DCM且左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)＜35%的患者心臟組織納入DCM組;因不匹配而不能用作移植的6例供體心臟作為對照組。本試驗(yàn)從2010年開始至2011年結(jié)束。

標(biāo)本收集和樣品制備:心肌組織的收集，DCM心肌組織取自接受心臟移植手術(shù)患者心臟的左心室游離壁;對照組取自不能用于移植的供體心臟左心室游離壁。標(biāo)本收集后均盡快放置于冰的含氧心肌麻痹液中，在液氮中凍存。將心肌組織從液氮中取出后盡快切成小塊，放入Polytron PT-MR210勻漿器中，并加入500 μl的裂解液，將勻漿器置于冰上進(jìn)行組織勻漿以防止蛋白降解。將勻漿液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，離心(14 000 rpm，4℃，30 min)，離心完成后將上清液轉(zhuǎn)移分裝，－80℃凍存?？捡R斯亮藍(lán)法(Bradford)測定蛋白質(zhì)濃度。

雙向凝膠電泳:按照 IPGphor等電聚焦系統(tǒng)(Amersham Biosciences公司)使用指南進(jìn)行操作。上樣500 μg，使用等電點(diǎn)為 pH3-10的非線性膠條(英國Amersham公司產(chǎn)品)進(jìn)行第一向電泳。(30 V 6 h、500 V 1 h、1 000 V 3 h、3 000 V 2 h、5 000 V 2 h、10 000 V 2 h、8 000 V 10 h、500 V 6 h)。然后使用12.5%的垂直板聚丙烯酰胺凝膠(SDS—PAGE)進(jìn)行第二向電泳(2W/膠30分鐘、12W/膠約6 h)，直至溴酚藍(lán)達(dá)膠底線。凝膠電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)染色及脫色。用ImageScanner掃描儀(Amersham Biosciences公司)獲取染色后的2-DE凝膠圖像，用 ImageMaster7.0軟件(Amersham Biosciences公司)分析掃描后的圖像。所有圖像中斑點(diǎn)檢測參數(shù)均設(shè)定為:①最小面積:10(像素單位);②平滑度:2;③顯著值:2。兩組間表達(dá)差異在1.5倍以上的蛋白點(diǎn)為差異蛋白點(diǎn)。

差異蛋白斑點(diǎn)的鑒定:沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，置于1.5 ml離心管。經(jīng)過水洗、脫色、還原與烷基化、膠內(nèi)酶切、萃取，然后點(diǎn)樣。制備好的點(diǎn)樣板放入美國ABI公司的ABI 4700 TOFTOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。胰酶消化了的肌紅蛋白作為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。所有實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)譜圖均以用默認(rèn)模式獲得。利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。利用英國 Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(http://www．matrixscience．com)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能。

差異蛋白的生物信息學(xué)分析:經(jīng)過質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)通過Ingenuity pathways analysis(IPA)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析(Ingenuity Pathway? Analysis，IPA，Ingenuity systems，www.ingenuity.com)。以 IPA 核心分析(Core Analysis)模塊對蛋白進(jìn)行生物功能抽提、疾病相關(guān)歸類等通路分析。

統(tǒng)計(jì)分析:所有分析使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示(±SD)，生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

DCM組患者和對照組供體的年齡和性別構(gòu)成比具有可比性。DCM組9例患者左心室射血分?jǐn)?shù)在14% ～35%之間，治療藥物主要包括地高辛、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶拮抗劑(ACEI)、β受體阻斷劑、利尿劑等。

DCM組和對照組心肌組織2-DE圖像:蛋白質(zhì)組學(xué)分析中每個(gè)樣品3次重復(fù)，總45塊2-DE膠，這些膠中蛋白點(diǎn)的總體分布顯示了高度的相似性。兩組代表性的2-DE圖像見圖1。950個(gè)可重復(fù)性蛋白點(diǎn)被納入分析，其中表達(dá)差異在1.5倍以上的蛋白點(diǎn)被認(rèn)為是差異蛋白點(diǎn)，共確定了25種差異蛋白，其中在DCM組15種表達(dá)上調(diào)，10種表達(dá)下調(diào)。

圖1 擴(kuò)張型心肌病組患者和對照組供體心肌組織2-DE圖像及差異蛋白點(diǎn)的分布(考馬斯亮藍(lán)染色)。差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索:使用德國Bruker Daltonics公司的TOF-TO串聯(lián)質(zhì)譜儀并搜索Mascot數(shù)據(jù)庫PMF分析鑒定出25種差異蛋白。1A:擴(kuò)張型心臟病組 1B:對照組

差異蛋白的生物信息學(xué)分析:采用綜合性的生物化學(xué)大辭海和多層次數(shù)據(jù)整合模擬與網(wǎng)絡(luò)分析的專業(yè)應(yīng)用軟件(IPA)對發(fā)現(xiàn)的差異蛋白分別進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、分子生物學(xué)功能和參與的生物學(xué)過程等分類。

差異蛋白的亞細(xì)胞定位:使用LOCATE數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白的亞細(xì)胞定位可知25種差異蛋白，大分子蛋白占10種，細(xì)胞骨架蛋白為7種，線粒體蛋白為7種，見圖2。差異蛋白的分子功能:蛋白的PANTHER分類顯示25種差異蛋白中，參與蛋白結(jié)合的18種，參與離子結(jié)合的6種，參與水解酶活性的5種，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的5種，見圖3。差異蛋白參與的生物學(xué)途徑:25種差異蛋白中，參與組織的形成過程13種，生物調(diào)節(jié)過程13種，發(fā)育過程12種，新陳代謝過程11種和對刺激的應(yīng)答過程為11種。見圖4。

圖2 差異蛋白的亞細(xì)胞定位

圖3 差異蛋白的分子功能

圖4 差異蛋白參與的生物學(xué)途徑

3 討論

研究表明DCM中發(fā)生改變的蛋白主要包括心肌蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、代謝相關(guān)蛋白、生長和增生蛋白、翻譯蛋白和轉(zhuǎn)錄蛋白以及未知功能的蛋白等［7］。通過蛋白組學(xué)分析，我們對DCM患者心肌組織蛋白改變進(jìn)行了全面篩選，共鑒定出25種差異蛋白，可分為幾個(gè)功能蛋白組:參與線粒體和能量代謝的蛋白、參與心肌收縮的蛋白及其它。

線粒體蛋白以及參與能量代謝的蛋白:本研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者和供體心肌組織之間25種差異蛋白中4種呼吸鏈相關(guān)蛋白復(fù)合物存在差異，包括NADH脫氫酶鐵硫蛋白3、二氫脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶亞基VB和λ2烯酰輔酶A異構(gòu)酶。該結(jié)果提示線粒體膜可能是化學(xué)滲透和氧化還原反應(yīng)的整合平臺。因此，心肌細(xì)胞的非同步功能障礙及其對能量的需求增加可能是導(dǎo)致上述呼吸鏈中相關(guān)酶表達(dá)增加的原因。這與超負(fù)荷導(dǎo)致的非心衰心肌肥厚模型的研究結(jié)果一致［8］。

心肌細(xì)胞收縮:我們研究表明，在DCM患者心肌組織發(fā)生改變的25種差異蛋白中，7種細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)顯著增加，包括肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白Ⅰ型3和甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

肌球蛋白輕鏈?zhǔn)切募∈湛s力產(chǎn)生的關(guān)鍵成分，這些蛋白表達(dá)改變均可影響心肌收縮力［9］。肌球蛋白輕鏈2的表達(dá)改變與DCM［10］、缺血再灌注損傷、心力衰竭的收縮功能不良有關(guān)。這些蛋白在DCM患者心肌組織中上調(diào)可能是對心肌肌動(dòng)蛋白減少的適應(yīng)性代償反應(yīng)。此外，本研究還觀察到肌球蛋白輕鏈2的表達(dá)改變可能是其磷酸化或脫氨基作用的變化并非總體表達(dá)增加。最近的研究顯示50%肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈突變，可通過擾亂肌肉纖維鈣離子濃度導(dǎo)致其機(jī)械功能障礙;同時(shí)，鈣敏感性和其與心肌纖維收縮力生成之間的協(xié)同性，可能直接與家族型心肌肥大的機(jī)制相關(guān)［11］。

另外一種重要的心肌收縮蛋白是肌鈣蛋白Ⅰ型3。該蛋白位于橫紋肌的細(xì)肌絲上，是肌鈣蛋白復(fù)合物的構(gòu)成蛋白。肌鈣蛋白Ⅰ型3為橫紋肌收縮提供了鈣敏感性開關(guān)，在缺血情況下能夠調(diào)節(jié)系統(tǒng)性動(dòng)脈血壓;并參與了心肌收縮的調(diào)節(jié)和心室肌纖維的形成過程。在鈣離子較低的情況下，肌鈣蛋白Ⅰ型3可結(jié)合肌動(dòng)蛋白，抑制肌動(dòng)球蛋白ATP酶活性［12］。細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)改變導(dǎo)致心肌收縮相關(guān)蛋白改變可能是DCM心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。

綜上所述，我們對DCM患者心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，25種蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，這些蛋白包括參與線粒體和能量代謝的蛋白、參與心肌收縮的蛋白等。這些差異蛋白的發(fā)現(xiàn)為深入探索DCM的發(fā)病機(jī)制和探索DCM的新的治療方法提供了有價(jià)值的信息;而且進(jìn)一步可能會有利于防治DCM的發(fā)生、改善DCM患者心臟功能、提高生活質(zhì)量和改善預(yù)后。

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Proteomic Study in Patients With Idiopathic Dilated Cardiomyopathy

YU Li-ping，SHI Lin-ying，ZHU Xiao-ming，CAI Jun，YANG Xin-chun，MENG Xian-min．
Department of Cardiology，Chaoyang Hospital，Capital University of Medical Science，Beijing(100020)，China

YANG Xin-chun，Email:yangxc99@gmail.com

Objective:To compare the differences of protein expression in myocardium between normal subjects and the patients with idiopathic dilated cardiomyopathy(DCM)by proteomic study and to explore the molecular basis of DCM.

Methods:Our work included 2 groups.DCM group，n=9，the patients’left ventricular ejection fraction ＜35%and

heart transplantation，the cardiac tissue for proteomic study taken from the free wall of their own left ventricle.Normal control group，n=6，the cardiac tissue from unmatched normal donors.The protein spectrum was examine by 2-D electrophoresis，the differential protein was identified by MS-MS method，and the position，function and interaction of differential proteins were investigated with Ingenuity pathway analysis.

Results:2-D electrophoresis presented similar protein spectrums for a total of 1000 spots in both groups，and the comparative analysis found 25 differential proteins，and 15 of them up-regulated and 10 down-regulated in DCM group.LOCATE database classification for sub cellular localization showed that there were 40%of macromolecular protein，28%of cytoskeleton protein and 28%of mitochondrial protein.PANTHER protein itemization indicated that the majority of proteins involved in cell structure，muscle contraction，calcium transportation and hydrolase activity.The biological protein category explored that the differential pro-teins participated in tissue processes，biological regulation，developmental and metabolic processes and the response to stimulus in the body.

Conclusion:There were 25 differential proteins involved in mitochondrial metabolism，myocardial contraction and apoptosis，which may play the important role in DCM development and process.

Dilated cardiomyopathy;Proteomics;Energy metabolism

100020北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 心臟中心(于麗平、史琳影、朱曉明、蔡軍、楊新春);阜外心血管病醫(yī)院(孟憲敏)

于麗平 副主任醫(yī)師 副教授 碩士生導(dǎo)師 碩士 主要從事高血壓和心臟病分子機(jī)制的研究工作Email:YHP@medmail.com.cn通訊作者:楊新春 Email:yangxc99@gmail.com*史琳影對本文有同等貢獻(xiàn)，并列為第一作者△為共同通訊作者 xmmengcn@163．com

R54

A

1000-3614(2013)01-0047-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.01.014

2012-03-26)

(編輯:常文靜)