油松花粉蛋白提取工藝的優(yōu)化

范三紅，王相帥，王亞云，胡雅喃，劉曉華

（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

松花粉，為鮮黃色或淡黃色細粉，其性味甘平無毒，顯微鏡下呈橢圓形或類球形，輪廓線明顯，表面有類圓形或多角形紋理或小顆粒狀突起，兩側各有一膨大的半圓形或近圓形氣囊，氣囊壁有明顯大小不一的網(wǎng)狀紋理，網(wǎng)眼呈多角形或類圓形[1]。松花粉藥名松花、松黃，始載于唐《新修本草》，松花粉是我國特有的鄉(xiāng)土樹種——馬尾松和油松的花粉[2]?；ǚ壑懈缓鞍踪|、氨基酸、碳水化合物、維生素、脂類等多種營養(yǎng)成分以及酶、輔酶、激素、黃酮、多肽、微量元素等生物活性物質，因此有“微型營養(yǎng)庫”之美譽[3]。人服用后能在很短的時間內(nèi)被人體快速吸收，促進人體正常新陳代謝，提高肌體免疫能力，對人類有很好的保健價值[4]。松花粉有這延緩衰老、抗疲勞、增強免疫力、降血脂等多種特殊功能，是一種天然的具有保健功能性的食品材料[5-7]。

油松花粉中含有的蛋白質，對人體的健康保健起著很大的作用。從油松花粉中分離出的蛋白質，可以用來研究其蛋白質的功能性質，用以研究出新的蛋白功能性食品。不僅如此，根據(jù)測定蛋白質的含量和對蛋白質的最佳提取工藝研究，可以研究出油松花粉在儲藏過程中蛋白質含量和功能性質的變化情況，為油松花粉的儲藏提供一些依據(jù)。

本實驗利用堿提酸沉法，分離提取油松花粉的蛋白，成本較低，省時高效，而且對實驗儀器的要求不是很高，是一種很普遍的提取蛋白的方法，可以為后續(xù)大量的提取油松花粉中的蛋白提供參考，并為進行深入研究蛋白質的功能性質提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油松花粉 山西省安澤縣惠原科貿(mào)有限責任公司；鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸 均為分析純。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；TG16A-WS型高速離心機 武漢愛斯佩科學儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；JP-040ST型超聲波清洗機 深圳市潔盟清洗設備有限公司；868型酸度計 美國奧利龍公司；JA1203N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；其他常用玻璃儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 油松花粉基本組成成分的測定 水分含量：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；灰分含量：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗蛋白含量：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；粗脂肪含量：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；還原糖測定：GB/T 5009.7-2008《食品中還原糖的測定》。

1.2.2 油松花粉破壁方法 采用溫差破壁和超聲波破壁復合方法：將花粉置于-18℃冰箱內(nèi)冷凍24h，迅速置于60℃的熱水中攪拌30min，之后迅速冷卻至室溫25℃，之后放入超聲波儀器中進行處理，超聲頻率40000Hz、超聲波功率為240W、超聲時間10min、超聲溫度為50℃，最后干燥后得破壁花粉[8-11]。

1.2.3 油松花粉蛋白等電點的測定 取4g花粉，以料液比1∶30加入120mL蒸餾水，放入超聲波破壁（40000Hz，240W，50℃，10min），之后調(diào)節(jié)pH10.04后，放入45℃恒溫水浴鍋，浸提60min，以3000r/min離心10min，取出上清液，并均勻倒入5個小燒杯，調(diào)節(jié)pH分別為2、3、4、5、6，再次以3000r/min離心10min，取出上清液，測定吸光度值。選取出吸光度值最小的一個區(qū)間，再以0.2為梯度，測定出準確的等電點[12]。此時蛋白質沉淀量最大，上清液的吸光度值最小。

1.2.4 油松花粉蛋白提取流程（采用堿提酸沉法提?。?破壁后的油松花粉→加入蒸餾水并調(diào)節(jié)pH為10→恒溫水浴鍋浸提→3000r/min、10min離心分離→分離出上清液→調(diào)節(jié)pH至油松花粉的等電點（pI）→3000r/min、10min離心分離→分離出沉淀物→水洗中和、均質、干燥→得到蛋白[13]。

1.2.5 油松花粉蛋白質提取率的計算 油松花粉蛋白質的提取率（%）=提取出的蛋白質質量/油松花粉中蛋白質的含量×100。

1.2.6 單因素實驗設計 采用控制變量法，分別研究料液比、提取液pH、提取時間、提取溫度四個因素對油松花粉蛋白提取的影響[14]。

1.2.6.1 料液比單因素實驗的設計 固定提取pH為10，溫度為45℃，提取時間為60min，離心速度為3000r/min，離心10min，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的條件下提取。

1.2.6.2 提取時間單因素實驗的設計 固定料液比為1∶30（g/mL），溫度為45℃，提取時間為60min，離心速度為3000r/min，離心10min，分別在提取pH為8、9、10、11、12的條件下提取。

1.2.6.3 提取pH單因素實驗的設計 固定提取pH為10，溫度為45℃，料液比為1∶30（g/mL），離心速度為3000r/min，離心10min，分別在提取時間為20、40、60、80、100min的條件下提取。

1.2.6.4 提取溫度單因素實驗的設計 固定提取pH為10，提取時間為60min，料液比為1∶30（g/mL），離心速度為3000r/min，離心10min，分別在提取溫度為25、35、45、55、65℃的條件下提取。

1.2.7 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上，進行正交實驗，選用料液比、pH、提取時間、提取溫度4個實驗因素為自變量，以油松花粉蛋白質提取率為考察指標，設計四因素三水平正交實驗[15]，確定出最佳提取條件。分析因素與水平實驗因素見表1。

表1 因素水平表Table 1 Different levels of factors

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實驗平行測定3次，采用Minitab軟件和Excel對數(shù)據(jù)處理，其結果以平均值±標準偏差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 油松花粉基本組分測定結果

表2 油松花粉基本組分含量（%）Table 2 Basic chemical composition of pine pollen（%）

通過對油松花粉基本組分進行測定[16]，測定結果由表2所示，該油松花粉的基本組分測定結果與參考文獻[17-21]記載均有一定差異，原因可能在于油松花粉的產(chǎn)地不同，生產(chǎn)的季節(jié)不同，這一點從不同參考文獻也可以說明。就該油松花粉的基本組分含量來看，還原糖和蛋白質的含量都相對較高，就為日后實驗研究油松花粉蛋白的理化性質打下了良好的基礎。其實驗數(shù)據(jù)還可為日后油松花粉資源的選擇性開發(fā)利用提供參考。

2.2 油松花粉蛋白等電點的測定結果

圖1 油松花粉蛋白的等電點Fig.1 Isoelectric point of pine pollen

根據(jù)蛋白質在等電點時溶解度最低的原理可知，在堿性環(huán)境中提取，之后再樣品中加酸，調(diào)節(jié)pH至等電點，蛋白質的沉淀量最大，上清液中蛋白質的含量是最低的，由此可以測得油松花粉蛋白的等電點（pI）。堿提酸沉法是很容易分離出樣品蛋白的方法，所以，要想優(yōu)化選擇油松花粉蛋白的提取條件，首先要測定出油松花粉蛋白的等電點。

根據(jù)前期實驗可以確定出油松花粉蛋白等電點的區(qū)間位于pH在3～4之間；進一步研究結果表明（圖1），當pH在3.6時，上清液吸光度值最小，由此可以得到油松花粉蛋白的等電點（pI）為3.6。

2.3 單因素實驗結果及分析

2.3.1 料液比對油松花粉蛋白提取率的影響 料液比對油松花粉蛋白提取率的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著料液比的增加，蛋白質提取率逐漸增加，在1∶30以后，蛋白質的提取率接近穩(wěn)定，蛋白質提取率的增加速度明顯減緩。當料液比較低時，油松花粉中的蛋白質不能充分的溶解，在進行酸沉階段，去除的沉淀中會含有大量的蛋白造成提取率降低[22]；同時當溶液量過大，成本上升，還會產(chǎn)生過多的廢液，而且由圖2可見，料液比在1∶30、1∶40和1∶50相差并不大，根據(jù)以上分析得出油松花粉蛋白提取的最佳料液比為1∶30（g/mL）。

圖2 料液比對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on protein yield

2.3.2 提取pH對油松花粉蛋白提取率的影響 堿提pH對油松花粉蛋白提取率的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著提取pH的增加，蛋白質的提取率先增大后減小，并且在pH為10時，蛋白質的提取率最大，可能是蛋白質在堿性環(huán)境下溶解度會增大，但是隨著pH得繼續(xù)升高，堿性增強，會使得蛋白質變性，內(nèi)部結構會改變，而且蛋白質會發(fā)生降解反應，這樣使得蛋白質的溶解度反而降低。同時，pH過高，蛋白質會進行不正常的化學反應，蛋白質會脫羧、脫氨、肽鍵斷裂產(chǎn)生有毒的物質，降低蛋白質的營養(yǎng)價值[23]。根據(jù)以上分析可以說明，油松花粉蛋白提取的最佳pH為10。

圖3 pH對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction pH on protein yield

2.3.3 提取時間對油松花粉蛋白提取率的影響 堿提時間對油松花粉蛋白提取率的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著提取時間的增加，蛋白質的提取率逐漸增大，在提取時間為100min時最大，這可能是因為：隨著提取時間的延長，蛋白質的溶解率會增大，但是增加一定程度時，蛋白質溶解率達到最大，再延長提取時間，蛋白質的提取率不會有明顯提高。提取時間為80、100min，兩者相比較，考慮到節(jié)省時間的因素，據(jù)此可以說明，油松花粉蛋白提取的最佳提取時間為80min。

圖4 堿提時間對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on protein yield

2.3.4 提取溫度對油松花粉蛋白提取率的影響 提取溫度對油松花粉蛋白提取率的影響結果見圖5。由圖5可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質的提取率逐漸增大，在提取溫度為55℃的時候，提取率最高，可能的原因是隨著溫度的升高，會增加蛋白質的溶解度，而且高溫使之前破壁不完全的花粉破壁，這樣蛋白質的溶解度會明顯升高。但是提取的溫度不能太高，因為高溫會使蛋白質變性，其內(nèi)部結構發(fā)生改變[24]。綜合以上因素，油松花粉蛋白提取的最佳提取溫度為55℃。

圖5 堿提溫度對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on protein yield

2.4 正交實驗結果及分析

根據(jù)單因素實驗結果，對料液比、提取pH、提取時間、提取溫度四因素進行采用L9（34）正交實驗，以蛋白質的提取率為實驗指標，確定油松花粉蛋白的最佳提取工藝。

表3 正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for the orthogonal array design

極差R反映各因素作用的大小，極差越大的因素對實驗指標所造成的影響也越大。由表3可知，RA（10.500）＞RB（4.600）＞RD（3.534）＞RC（1.000），四個因素對實驗結果的影響次序為：A＞B＞D＞C，即料液比對蛋白質提取率的影響最大，提取pH的影響次之，其次為提取溫度，而提取時間對蛋白質的提取率影響最小。

由表3中的極差分析可知，本實驗的最佳提取組合為A3B3C2D2，即料液比1∶40（g/mL）、提取pH為11、提取時間80min、提取溫度55℃。

從表4的方差分析可知，料液比對油松花粉蛋白質的提取率的影響顯著，而其他因素均不顯著。

2.5 驗證實驗

因為正交實驗確定出的最佳組合A3B3C2D2并不在正交表中，所以按此條件做3次實驗進行驗證。得到油松花粉蛋白的提取率為56.3%±0.3%，大于正交實驗中的任意一組提取率，由此證明，此最佳提取工藝是可行的。

3 結論

油松花粉蛋白的等電點為3.6。影響油松花粉蛋白質提取率各因素的主次順序是：料液比＞pH＞提取溫度＞提取時間，油松花粉蛋白質的最佳提取工藝條件為：料液比1∶40（g/mL）、pH為11、提取時間80min、提取溫度55℃，此時提取率可達56.3%。

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