響應(yīng)面法優(yōu)化類脂囊泡包埋辣椒紅色素的研究

李 賢，武彥文，歐陽(yáng)杰，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；

2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京 100083；

3.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

響應(yīng)面法優(yōu)化類脂囊泡包埋辣椒紅色素的研究

李 賢1，2，武彥文3，歐陽(yáng)杰1，2，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；

2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京 100083；

3.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了辣椒紅色素類脂囊泡制備過(guò)程中影響包封率的因素，并且利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了制備條件。結(jié)果表明，辣椒紅色素的加入量、超聲時(shí)間和囊泡類型是影響包封率的主要因素，其中辣椒紅色素的加入量和超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響顯著。包封率較高的制備工藝條件為：辣椒紅色素添加量0.05g、膽固醇0.2g、HLB=8.2的復(fù)配表面活性劑0.4g（司盤80=0.27g，吐溫20=0.13g）、超聲時(shí)間24min。在此條件下類脂囊泡的包封率為82.4%，誤差2.3%，重復(fù)性較好。

類脂囊泡，辣椒紅色素，響應(yīng)面分析

辣椒紅色素是由茄科紅辣椒的果皮中得到的一種橙黃或橙紅色的天然紅色素，屬于類胡蘿卜素類共軛多烯烴含氧衍生物，主要成分為辣椒紅素和辣椒玉紅素[1]。辣椒紅色素主要用于糕點(diǎn)、冰淇淋、餅干、糖果和熟肉制品等食品的著色[2]。辣椒紅色素的穩(wěn)定性主要受溫度、pH、熱、光等因素的影響[3－4]，其中光對(duì)它的穩(wěn)定性影響較大[5－6]。此外，辣椒紅素在有氧條件下易發(fā)生氧化反應(yīng)，設(shè)法增強(qiáng)辣椒紅色素的穩(wěn)定性以及對(duì)外界不良影響的抵抗能力是能否得到更廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵[7]。

類脂囊泡由非離子型表面活性劑自組裝形成，適量加入尿素等鹽類物質(zhì)可以促進(jìn)囊泡的自發(fā)形成[8]。類脂囊泡具有閉合的雙分子膜結(jié)構(gòu)，又稱非離子表面活性劑囊泡。結(jié)構(gòu)上分為單室囊泡和多室囊泡兩大類，粒徑在30～1000nm之間，物理性質(zhì)與脂質(zhì)體相似[9]。類脂囊泡具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，無(wú)毒、無(wú)免疫原性，親水親脂藥物都能包裹，還可以對(duì)其表面進(jìn)行修飾來(lái)制備特殊用途的囊泡[10]，前體類脂囊泡在儲(chǔ)藏中更穩(wěn)定[11]。因此，類脂囊泡可以提高被包埋物質(zhì)的穩(wěn)定性，有效控制被包埋物質(zhì)的釋放，延長(zhǎng)緩釋作用時(shí)間[12]。此外，與脂質(zhì)體相比，非離子表面活性劑囊泡的載體材料不含磷脂，避免了磷脂的氧化降解，生產(chǎn)和貯存皆不需特殊條件，可使工藝簡(jiǎn)化、成本降低，是一種極有希望的新型藥物載體[13]。本研究利用類脂囊泡技術(shù)來(lái)包埋辣椒紅色素，以提高其穩(wěn)定性，擴(kuò)大在食品中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒紅色素 北京金曄生物工程有限公司；司盤80、吐溫20、膽固醇 食品級(jí)，含量95%；氯仿、乙醇、正己烷等化學(xué)試劑 均為分析純。

冷凍離心機(jī)Biofuge Primo 德國(guó)Heraeus公司；752紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 類脂囊泡的制備方法

稱取膽固醇0.2g和一定量的辣椒紅色素，再稱取0.4g不同HLB值的由司盤和吐溫復(fù)配的表面活性劑，放入梨形燒瓶中，加20mL體積為比4∶1的氯仿/乙醇有機(jī)溶劑，混合至完全溶解[14]。將梨形燒瓶放入45℃水浴中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑至成膜。將一定量的0.1mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液加入梨形燒瓶中，旋轉(zhuǎn)振搖水化脂質(zhì)干膜，超聲處理一定時(shí)間，使貼壁的所有類脂囊泡從壁上脫落，形成均勻液體，即得類脂囊泡懸浮液。

1.3 類脂囊泡包封率的測(cè)定方法

式中，Q：包封率（%）；C：未被包埋的色素濃度（mg/mL）；V：正己烷體積（mL）；m：投入的總色素量（mg）。

將制得的類脂囊泡懸浮液以8000r/min于4℃離心10min，再取上清液過(guò)0.45μm的濾膜抽濾，在濾液中加入正己烷和乙醇萃取至無(wú)色，分液后取正己烷萃取液于460nm下測(cè)定吸光度值。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的公式：濃度[c（mg/mL）]=[吸光度值（A460nm）+0.0039]/ 13.966計(jì)算得出未被包埋的色素濃度（c），并計(jì)算出包封率[15]：

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以囊泡的包封率為指標(biāo)，按照1.2的實(shí)驗(yàn)方法制備類脂囊泡懸浮液，以表面活性劑HLB值、辣椒紅色素加入量、超聲時(shí)間為單因素進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，并按1.3的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定類脂囊泡的包封率，分別確定三個(gè)單因素的最適反應(yīng)條件。

1.4.1 表面活性劑HLB值對(duì)包封率影響的單因素實(shí)驗(yàn) 取0.4g由司盤80和吐溫20復(fù)配的不同HLB值的表面活性劑、0.2g膽固醇、0.06g辣椒紅色素、20mL氯仿/乙醇溶劑，混合溶解完全。將混合液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜，再加入磷酸鹽緩沖液旋轉(zhuǎn)振搖水化干膜，同時(shí)超聲處理10min，測(cè)定不同類型的囊泡對(duì)包封率的影響。復(fù)配的表面活性劑的HLB計(jì)算公式為：HLB= HLBi×Wi+HLBii×（1－Wi），i為司盤80，ii為吐溫20，Wi為司盤80所占的比例。表面活性劑HLB值復(fù)配方案見表1。

表1 表面活性劑HLB值配方Table 1 Ingredient of HLB of surfactant

1.4.2 辣椒紅色素加入量對(duì)包封率影響的單因素實(shí)驗(yàn) 取0.4g HLB值為8.4的復(fù)配乳化劑、0.2g膽固醇、20mL氯仿/乙醇溶劑，加入的辣椒紅色素分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g。分別將混合液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜，再加入磷酸鹽緩沖液旋轉(zhuǎn)振搖水化干膜，同時(shí)超聲處理10min，考察不同辣椒紅色素加入量對(duì)包封率的影響。

1.4.3 超聲時(shí)間對(duì)包封率影響的單因素實(shí)驗(yàn) 取0.4g HLB值為8.4的復(fù)配乳化劑、0.2g膽固醇、0.04g辣椒紅色素、20mL氯仿/乙醇溶劑，將混合液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜，再加入磷酸鹽緩沖液旋轉(zhuǎn)振搖水化干膜，制備的懸濁液五等分，分別超聲處理10、15、20、25、30min，考察不同超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響。

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取表面活性劑HLB值、辣椒紅色素加入量、超聲時(shí)間為自變量，囊泡的包封率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其因素水平編碼表見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)Table 2 Factor design of response surface experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 類脂囊泡包埋辣椒紅色素的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 表面活性劑HLB值對(duì)包封率的影響 由圖1可知，不同HLB值的類脂囊泡對(duì)辣椒紅色素的包封率不同，當(dāng)HLB值小于8.4時(shí)，隨著HLB值的增加，包封率逐漸升高。當(dāng)HLB值為8.4時(shí)，包封率達(dá)到最大值，HLB＞8.4時(shí)，隨著HLB值的增加，包封率降低。表

圖1 表面活性劑HLB值對(duì)包封率的影響

Fig.1 Effect of HLB of surfactant on the encapsulation efficiency of niosomes面活性劑的HLB值是表面活性劑的親水親油平衡值，即表面活性劑親水能力與親油能力的比值。適當(dāng)?shù)腍LB值可以使表面活性劑分子更好的在辣椒紅色素和水溶液的界面上排列，形成包封率高的囊泡，這與表面活性劑在水相和油相之間的界面張力有關(guān)，與辣椒紅色素的油溶性相關(guān)。當(dāng)HLB值為8.4時(shí)，表面活性劑在辣椒紅色素表面的吸附量最大，因此包封率最高。當(dāng)HLB值大于8.4時(shí)，表面活性劑親水性逐漸變強(qiáng)，界面張力變大，因此包封率降低。

2.1.2 辣椒紅色素加入量對(duì)包封率的影響 由圖2可得知，辣椒紅色素的加入量對(duì)包封率有影響。當(dāng)加入量小于0.04g時(shí)，包封率隨加入量增加而增大，可能是由于加入辣椒紅色素的量未達(dá)到類脂囊泡包封的飽和度；加入量大于0.04g時(shí)，包封率隨加入量增加反而減小，可能是由于囊泡已飽和，導(dǎo)致包封率下降。加入量為0.04g時(shí)包封率達(dá)到最大值。

圖2 辣椒紅色素加入量對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of paprika red content on the encapsulation efficiency of niosomes

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響 由圖3可得知，當(dāng)超聲時(shí)間為20min時(shí)，包封率達(dá)到最大值，超聲時(shí)間小于20min時(shí)，超聲處理對(duì)包封率有促進(jìn)作用，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致包封率下降，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲會(huì)引起囊泡破裂，包封率降低。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of sonication time on the encapsulation efficiency of niosomes

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化包埋辣椒紅色素的條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，用三因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化測(cè)定條件。隨機(jī)設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組實(shí)驗(yàn)，其中中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)5個(gè)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。以A囊泡HLB值、B辣椒紅色素添加量、C超聲時(shí)間為自變量，以類脂囊泡包封率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface experiment

利用Design Expert 7.1軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)方案中類脂囊泡包封率測(cè)定結(jié)果的響應(yīng)值及3個(gè)主要影響因素（表1），進(jìn)行多元回歸分析和最小二乘法擬合，得到響應(yīng)值對(duì)編碼變量的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=79.2+1.28A+2.86B+2.34C－1.63AB－4.53AC+ 13.05BC－16.78A2－7.7B2－11.4C2

對(duì)公式進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)，回歸分析結(jié)果見表4。

表4 回歸分析結(jié)果表Table 4 Regression analysis table

從表3的分析結(jié)果來(lái)看，該回歸模型的R2=0.925， F=54.7，表明92.5%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋，說(shuō)明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合好。整體模型的p值小于0.001，所以該方程是高度顯著的。而失擬項(xiàng)的F值為0.77，大于0.05，說(shuō)明與凈誤差相關(guān)的失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型擬和結(jié)果較好，從另一種意義上講，這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的，從而表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)判定。由表3可以看出，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響大小次序?yàn)椋築＞C＞A，即辣椒紅色素添加量＞超聲時(shí)間＞囊泡HLB值。這表明，辣椒紅色素的加入量是影響類脂囊泡包封率的最顯著因素，其次為超聲時(shí)間，囊泡的HLB值對(duì)包封率影響不顯著。

2.3 測(cè)定條件的響應(yīng)面分析

為了分析任意兩因素的交互作用，固定第三個(gè)因素為零水平，考察其余兩個(gè)因素的交互作用，即得到響應(yīng)面，如圖4～圖6所示。響應(yīng)面緩說(shuō)明交互作用不顯著，響應(yīng)面陡說(shuō)明交互作用顯著。由圖4～圖6可得，圖4響應(yīng)面較圖5和圖6平緩，說(shuō)明AB交互作用不顯著，AC與BC交互作用顯著。由表3可知，交互項(xiàng)AC、BC，所有二次項(xiàng)也均達(dá)到極顯著水平，其他因素間的交互作用項(xiàng)不顯著?；貧w分析與響應(yīng)面趨勢(shì)分析得出的結(jié)論相一致。另外從系數(shù)項(xiàng)的p值看，一次項(xiàng)B、C達(dá)到顯著水平。表明各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

圖4～圖6直觀的給出了個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面圖。從圖中可以得出響應(yīng)面存在最高點(diǎn)，即存在極值。特征值均為負(fù)值，說(shuō)明有極大值存在，即為最大包封率。

圖4 HLB值和辣椒紅色素添加量對(duì)包封率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Responsive surface of HLB and paprika red content on the encapsulation efficiency

圖5 辣椒紅色素添加量和超聲時(shí)間對(duì)包封率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Responsive surface of sonication time and paprika red content on the encapsulation efficiency

圖6 HLB值和超聲時(shí)間對(duì)包封率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Responsive surface of sonication time and HLB on the encapsulation efficiency

2.4 最佳條件的預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，得到制備類脂囊體的最佳條件為：囊泡HLB值為8.2，超聲時(shí)間24min，辣椒紅色素加入量為0.05g，預(yù)測(cè)響應(yīng)值為80.47%。為檢驗(yàn)可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的響應(yīng)值分別是為80.2%、82.3%、84.6%，平均值為82.4%，與理論值的誤差為2.3%。

3 結(jié)論

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在辣椒紅色素添加量、超聲時(shí)間和囊泡HLB值三個(gè)影響包封率的因素中，辣椒紅色素添加量和超聲時(shí)間影響顯著。實(shí)際操作得出包封率較高的工藝條件為：辣椒紅色素添加量0.05g、膽固醇0.2g、HLB=8.2的復(fù)配表面活性劑0.4g（司盤80=0.27g，吐溫20=0.13g）、超聲時(shí)間24min。在此條件下類脂囊泡包封率為82.4%，誤差2.3%，重復(fù)性較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，通過(guò)本文的方法制備辣椒紅色素的類脂囊泡是可行的，該法包封率高、重復(fù)性較好、比脂質(zhì)體成本低，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究辣椒紅色素類脂囊泡對(duì)光照和熱的穩(wěn)定性。

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Study on optimization of encapsulation of paprika red in niosomes by response surface methodology

LI Xian1，2，WU Yan-wen3，OUYANG Jie1，2，*
（1.Department of Food Science and Engineering，College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
3.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China）

Factors affecting the encapsulation efficiency in preparing noiosomes were investigated in the presented study，and the optimal condition was obtained by response surface analysis.Results showed that the content of paprika red，ultrasonic time and the HLB of surfactant were the major factors，and the effects of paprika red content and ultrasonic time were significant.Optimal conditions were that the content of paprika red was 0.05g，cholesterol was 0.2g，mixed surfactant which HLB value was 8.2，weight was 0.4g（span 80 was 0.27g，tween 20 was 0.13g）and the sonication time was 24min.Under above conditions，noisome encapsulation rate reached 82.4%，standard error was 2.3%，and good reproducibility was observed.

niosome；paprika red；response surface analysis

TS202.3

A

1002－0306（2013）22－0271－05

2013－03－27 *通訊聯(lián)系人

李賢（1987－），女，碩士研究生，研究方向：食品添加劑與食品生物技術(shù)。

北京市科委科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展工程項(xiàng)目（Z121106002812037）；第44批留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目。