微波輔助提取枇杷花中齊墩果酸和熊果酸的工藝優(yōu)化

汪文浩，鄭美瑜，陸勝民，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江杭州310021）

枇杷（Eriobotrya japonica）系薔薇科枇杷屬植物，是一種具有藥用價(jià)值的小型亞熱帶常綠果樹，在我國(guó)已經(jīng)有2200多年的種植歷史，目前產(chǎn)區(qū)主要分布在浙江、福建、安徽、四川等省區(qū)。枇杷花為枇杷的花蕾及花序，干燥后呈現(xiàn)綠白色、白色或淡黃色。據(jù)記載，枇杷花可以“止渴下氣，利肺氣，止吐逆，清上焦熱，潤(rùn)五臟”[1]，有清火、解熱、潤(rùn)喉、利肺、化痰止咳、治頭痛傷風(fēng)等功能，臨床上可用于急、慢性呼吸道疾病的治療[2]。

目前從枇杷花中分離出的生物活性成分主要有黃酮類、多酚類、三萜酸類、苦杏仁苷等[3-4]，其中三萜酸類具有較好的抗病毒、降血糖[5]、抗炎[6]等作用。枇杷花中的三萜酸類化合物主要是齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA）和熊果酸（Ursolic Acid，UA）及其以它們?yōu)槟阁w的衍生物[7]。目前，OA、UA的提取方法有熱回流提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等，其中微波輔助提取比傳統(tǒng)的熱回流提取的時(shí)間短，得率高[8]，適用于天然活性成分的提取[9]。本研究首次利用微波輔助提取技術(shù)對(duì)枇杷花中OA、UA進(jìn)行提取，以O(shè)A、UA綜合提取量為指標(biāo)，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行工藝的篩選及優(yōu)化，為枇杷花的綜合利用及新產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷花 由杭州市余杭區(qū)塘棲枇杷花研究所提供，新鮮枇杷花經(jīng)清洗后于80℃干燥5h，粉碎后備用；OA、UA標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品鑒定所；甲醇（色譜純） 百靈威科技有限公司；所用其他試劑 均為分析純。

P1201型高效液相色譜儀（D230+二極管陣列檢測(cè)器、P230型高壓恒流泵、AS120型自動(dòng)進(jìn)樣器、AXW-5柱溫箱） 大連依利特分析儀器有限公司；WF-4000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng) 上海屹堯微波化學(xué)技術(shù)有限公司；LXJ-HB型飛鴿離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司；AL104-1C型電子天平METTLER TOLEDO公司；SHB-A型循環(huán)水真空泵、RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析檢測(cè)方法

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（94∶6），流速0.5mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取OA 22.9mg、UA 30.0mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成916mg/L OA、1200mg/L UA的混合溶液。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25、0.5、1、2、3、4mL于10mL容量瓶中，甲醇定容。精密吸取上述不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以樣品濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.3 樣品中OA、UA的檢測(cè) 精密稱取干燥并粉碎的枇杷花樣品0.5g于微波萃取瓶中，加入乙醇溶液進(jìn)行微波輔助提取，提取結(jié)束后于5000r/min離心15min，取上清液減壓濃縮至干燥，殘留物用甲醇溶解，進(jìn)樣前過(guò)0.45μm濾膜，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量10μL。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇 在提取溫度為70℃、液固比為40∶1（mL/g）、微波功率為200W條件下，選取體積分?jǐn)?shù)分別為35%、50%、65%、80%、95%的乙醇溶液提取50min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響。

1.2.2.2 提取時(shí)間選擇 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度為70℃，液固比為40∶1（mL/g），微波功率為200W條件下，分別提取10、20、30、40、50、60min，考察不同提取時(shí)間對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響。

1.2.2.3 提取液固比選擇 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度為70℃，微波功率為200W條件下，在液固比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）時(shí)提取50min，考察不同液固比對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響。

1.2.2.4 微波輔助提取功率選擇 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度為70℃，液固比為40∶1（mL/g）條件下，在微波功率為100、200、300、400、500W時(shí)提取50min，考察不同微波功率對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響。

1.2.2.5 提取溫度選擇 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，微波功率為300W，液固比為40mL/g時(shí)，在提取溫度為40、50、60、70、80℃條件下提取50min，考察不同提取溫度對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響。

1.2.3 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間、微波功率四個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，提取溫度為50℃，確定最佳提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)枇杷花中OA、UA的含量比值大約為1∶5（見(jiàn)圖1），采用權(quán)重法衡量工藝參數(shù)[10]。綜合指標(biāo)=（OA含量平均值/OA含量最大值）×0.17×100+（UA含量平均值/UA含量最大值）×0.83×100。綜合指標(biāo)值越大，表明對(duì)枇杷花中OA和UA的總的提取量越大。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 枇杷花中OA、UA提取方法的比較

1.2.4.1 微波輔助提取枇杷花中OA、UA 精確稱取枇杷花樣品0.5g，加入20mL 80%乙醇，于50℃提取50min，微波功率為300W。

1.2.4.2 熱回流提取枇杷花中OA、UA 考慮到提取液體積太少，熱回流提取無(wú)法實(shí)現(xiàn)虹吸，本實(shí)驗(yàn)選用的提取液體積為100mL。精確稱取枇杷花樣品2.5g，加入100mL 80%乙醇，于50℃條件下回流提取50min。

1.2.4.3 超聲波輔助提取枇杷花中OA、UA 精確稱取枇杷花樣品0.5g，加入20mL 80%乙醇，于50℃提取50min，超聲功率為300W。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin軟件進(jìn)行作圖。正交實(shí)驗(yàn)、提取方法比較實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 OA、UA線性關(guān)系及色譜圖分析

OA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.2714X+0.5633，R2=0.9994，UA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.2395X+1.3949，R2=0.9990。樣品平行5次，進(jìn)行精密度檢驗(yàn)，OA的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.45%，UA的RSD為1.17%，表明儀器精密度良好。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。在上述色譜條件下，色譜圖中標(biāo)準(zhǔn)品與樣品OA、UA在出峰時(shí)間附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)，且分離度大于1.5。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響 由圖2可以看出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)低于80%時(shí)，OA、UA的提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，這是因?yàn)镺A、UA為弱極性分子，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大有利于OA、UA的溶出。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時(shí)，OA、UA的提取量反而下降，可能是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖际沟鞍踪|(zhì)變性加快，在一定程度上抑制了乙醇向細(xì)胞內(nèi)的滲透[11]，妨礙了OA、UA的溶出，從而影響了OA、UA的提取量，因此正交實(shí)驗(yàn)選用乙醇體積分?jǐn)?shù)條件為65%、80%和95%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard and sample

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction yield of OA and UA in loquat flowers

圖3 提取時(shí)間對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of OA and UA in loquat flowers

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響 由圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，OA、UA的提取量逐漸增加，在50min時(shí)，提取量達(dá)到最大，枇杷花中OA、UA基本上全部溶出。在60min時(shí)，提取量已接近飽和并有輕微的下降，可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)OA、UA的結(jié)構(gòu)造成破壞，引起提取量的下降，因此正交實(shí)驗(yàn)選用的提取時(shí)間條件為40、50、60min。

2.2.3 液固比對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響 由圖4可以看出，在液固比較小時(shí)，OA、UA提取量隨液固比的增加而升高。在液固比達(dá)到40∶1（mL/g）時(shí)，OA、UA的提取量達(dá)到最大值，液固比繼續(xù)增加，提取量反而下降，可能是因?yàn)樘崛∪軇┯昧窟^(guò)多時(shí)，會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)的溶出[12]，而且會(huì)使?jié)饪s時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，增加能耗，降低回收率，因此正交實(shí)驗(yàn)選用的液固比條件為30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）。

圖4 液固比對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響Fig.4 Effects of liquid/solid ratio on extraction yield of OA and UA in loquat flowers

2.2.4 微波功率對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響 如圖5所示，隨著微波功率增加，提取液的升溫速度加快，增加了料液擴(kuò)散的速度，提高了提取量。但是當(dāng)功率達(dá)大于300W時(shí)，提取量接近平衡并緩慢下降，可能是升溫速度過(guò)快，造成了提取液的爆沸，造成了提取液的損失[13]，而且功率增加會(huì)增加能耗，因此正交實(shí)驗(yàn)選用的微波功率條件為100、200、300W。

圖5 微波功率對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響Fig.5 Effects of microwave power on extraction yield of OA and UA in loquat flowers

2.2.5 提取溫度對(duì)OA、UA提取量的影響 由圖6可以看出，在溫度較低條件下，提取量隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度超過(guò)50℃后提取量反而下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)加速乙醇的揮發(fā)，降低提取液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)，從而降低了提取量，因此提取溫度選擇50℃。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照表1進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)綜合指標(biāo)進(jìn)行方差分析結(jié)果如表3所示。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2Result of orthogonal experiments L9（34）

圖6 提取溫度對(duì)枇杷花OA、UA提取量的影響Fig.6 Effects of extraction temperature on extraction yield of OA and UA loquat flowers

由表2可以看出，影響枇杷花中OA、UA提取量的因素的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋ˋ）＞液固比（B）＞微波功率（D）＞提取時(shí)間（C）；枇杷花中OA、UA的提取的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度80%，液固比40∶1（mL/g），提取時(shí)間50min，微波功率300W，提取溫度50℃。由表3中方差分析可以看出，乙醇濃度、液固比對(duì)枇杷花中OA、UA提取量的影響呈現(xiàn)顯著水平。

按照A2B2C2D3的條件進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，OA、UA提取量分別達(dá)到0.482、3.118mg/g，RSD分別為1.973%和1.830%，綜合指標(biāo)為98.631±1.498。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在此條件下提取的OA、UA含量的綜合指標(biāo)達(dá)到最大值，且具有良好的重復(fù)性，因此確定A2B2C2D3為最佳工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，液固比40∶1mL/g，提取時(shí)間50min，微波功率300W。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4 枇杷花中OA、UA提取方法的比較

枇杷花中OA、UA超聲波輔助提取、熱回流提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，并與微波輔助提取的最佳工藝條件的提取量進(jìn)行比較。從表4中可以看出，利用超聲波輔助提取OA、UA的提取量大于熱回流提取，但與微波輔助提取的綜合指標(biāo)相比，OA、UA提取量均低于微波輔助提取的結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究探明了枇杷花中OA、UA的微波輔助提取工藝，以提取物中OA、UA綜合含量作為指標(biāo)，通過(guò)單因素與正交實(shí)驗(yàn)得出，各因素對(duì)提取量的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋疽汗瘫龋疚⒉üβ剩咎崛r(shí)間，其中乙醇濃度、液固比兩個(gè)因素對(duì)提取量有顯著影響（p＜0.05），最佳提取工藝為：乙醇濃度80%，液固比40∶1mL/g，提取時(shí)間50min，微波功率300W，提取溫度50℃。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，OA提取量達(dá)到0.482mg/g，UA提取量達(dá)到3.118mg/g，且重復(fù)性良好。

表4 微波輔助提取、超聲波輔助提取、熱回流提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of microwave-assisted extraction，ultrasonic-wave assisted extraction and thermo-refluxing extraction experiments

本研究還對(duì)枇杷花中OA、UA的不同提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，在乙醇濃度80%，液固比40∶1（mL/g），提取時(shí)間50min，提取溫度50℃，微波功率300W條件下，采用微波輔助提取枇杷花中OA、UA的提取量顯著高于超聲波輔助提取和熱回流提取。

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