益生菌微膠囊二次包衣工藝的優(yōu)化

鄒 強，梁華忠，龔雷淋，劉達玉，王 衛(wèi)，李 翔，*

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，食品加工和應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川成都610106；2.四川高福記生物科技有限公司，四川成都610106）

微膠囊技術(shù)作為益生菌的包埋手段之一，它常被用來提高益生菌在不良環(huán)境中的存活率以達到益生菌腸道釋放的目的[1-4]。目前，海藻酸鈉和蛋白質(zhì)是益生菌包埋研究中常采用的兩種壁材，但這兩者均存在著各自的不足之處。海藻酸鈉膠體對酸和胃蛋白酶穩(wěn)定，并且進入到小腸消化環(huán)境后，又會逐漸轉(zhuǎn)變成可溶解的粘性層[5]，最終在結(jié)腸中被消化，因此利用海藻酸鈉包埋益生菌有利于實現(xiàn)益生菌的腸道釋放。但是海藻酸鈉膠體多孔的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得它并不能完全有效地限制小分子有害物質(zhì)的滲透，所以它對益生菌的保護效果也非常有限[6]。蛋白質(zhì)雖然具有優(yōu)良的乳化、凝膠和阻隔能力，但它不耐胃酸，并且在胃蛋白酶的作用下易水解，所以在人體胃部，蛋白質(zhì)微膠囊對益生菌的保護效果也并不理想[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，利用海藻酸鈉對明膠微膠囊進行二次包衣能夠提高明膠對胃蛋白酶的穩(wěn)定性，從而提高包埋益生菌在模擬胃液中的存活率，并實現(xiàn)腸道釋放[7]。該方法彌補了海藻酸鈉和蛋白質(zhì)作為益生菌包埋壁材的各自缺點，為建立改良的益生菌包埋體系提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是海藻酸鈉和蛋白質(zhì)之間涉及到復(fù)雜的相互作用，外界環(huán)境條件對這種作用影響很大，目前并沒有研究系統(tǒng)地考察二次包衣條件對益生菌包埋效果的影響。因此本研究以乳清蛋白微膠囊為研究對象，采用海藻酸鈉對其進行二次包衣，考察不同包衣條件對微膠囊粒徑和包埋益生菌在模擬胃液中存活率的影響，由此來確定海藻酸鈉包衣蛋白質(zhì)微膠囊的最佳參數(shù)和條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兩歧雙歧桿菌F-35（B.bifidum F-35） 本實驗室保藏；分離乳清蛋白（WPI，94.0%） 北京銀河經(jīng)貿(mào)有限公司；海藻酸鈉 Sigma公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Tgase，1000U/g） 江蘇一鳴生物科技有限公司；胃蛋白酶（10000NFU·mg-1） BBI公司；吐溫20（分析純） 上海勁馬實驗設(shè)備有限公司。

ULTRA-TURRAX T8型均質(zhì)機 德國IKA公司；Leica DM2000型光學(xué)顯微鏡 德國萊卡公司；BT-9300H型激光粒度分析儀 遼寧百特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)微膠囊的制備 參照鄒強等[8]的制備方法：將2mL濃縮菌液與30mL預(yù)熱（40℃）的乳清蛋白溶液（10%，w/v）混合后，快速加入Tgase（10U/g蛋白質(zhì)）并漩渦振蕩使其分散均勻，將此混合液加入到盛有150g預(yù)熱的（40℃）大豆油的250mL錐形瓶中，然后使該體系在磁力攪拌器的作用下（900r/min，40℃）反應(yīng)180min，待液滴在酶的作用下轉(zhuǎn)化為凝膠顆粒后離心（500×g，1min），收集微膠囊顆粒并用林格氏試劑溶液清洗兩次，在700×g下離心5min，重新收集膠體顆粒，儲藏于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 海藻酸鈉二次包衣實驗 主要參照Annan等[7]的包衣方法，具體工藝流程如圖1所示，并在此基礎(chǔ)上對工藝進行優(yōu)化，其中包衣過程需要考察的實驗條件如表1所示。

表1 海藻酸鈉包衣過程中的實驗條件Table 1 Experimental condition of alginate coating on microcapsules

圖1 海藻酸鈉二次包衣的工藝流程Fig.1 The process flow of double-coating

1.2.3 微膠囊的形態(tài)觀察及其粒徑分析 取一小滴微膠囊分散液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。微膠囊的粒徑分布通過激光粒度分析儀測定，平均粒徑表示為體積平均粒徑D（4.3）。

1.2.4 B.bifidum F-35在模擬胃液中的存活實驗人體模擬胃液（SGJ）的制備參照zou等[9]的方法，將0.5mL濃縮菌液或者0.5g微膠囊加入到4.5mL的SGJ中（37℃預(yù)熱），用漩渦振蕩器充分振蕩10s，然后在37℃，100r/min下溫育2h，之后用高速均質(zhì)器對樣品溶液進行破碎，用ULTRA-TURRAX T8均質(zhì)機在10000r/min下均質(zhì)45s，取樣，用涂布平板法計算活菌數(shù)，其中存活率（SY）表示為：SY（%）=N/N0×100，N為經(jīng)處理后，模擬胃腸液中存活的細胞總數(shù)，N0為在處理之前的細胞活菌總數(shù)。

1.2.5 二次包衣工藝的優(yōu)化實驗 將海藻酸鈉溶液濃度、攪拌速度、CaCl2濃度分別固定為0.5%、500r/min和0.05mol/L，考察pH對包衣效果的影響；海藻酸鈉溶液pH、攪拌速度、CaCl2濃度分別固定為5.5、500r/min和0.05mol/L，考察海藻酸鈉溶液濃度對包衣效果的影響；海藻酸鈉溶液濃度、pH、CaCl2濃度分別固定為0.5%、5.5以及0.05mol/L，考察攪拌速度對包衣效果的影響；海藻酸鈉溶液濃度、海藻酸鈉溶液pH、攪拌速度分別固定為0.5%，5.5以及500r/min，考察氯化鈣濃度對包衣效果的影響。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 獨立實驗至少重復(fù)三次，結(jié)果應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)值以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用One-way ANOVA法統(tǒng)計分析其顯著性，p＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對包衣效果的影響

隨著pH的降低，包衣后的微膠囊對B.bifidum F-35的保護效果越好。特別是pH在5.5時，包埋的B.bifidum F-35在模擬胃液中的存活率遠高于pH為6.78和6.0時的存活率，這可能是因為較高pH的包衣環(huán)境會使得蛋白質(zhì)和海藻酸鈉之間的負靜電斥力增加，從而影響海藻酸鈉對乳清蛋白微膠囊的包衣效果，但是繼續(xù)降低pH非但沒有顯著提高微膠囊對B.bifidum F-35保護效果，還可能因為偏酸性的包衣環(huán)境對包埋的B.bifidum F-35產(chǎn)生致死作用。另外，海藻酸鈉溶液pH對微膠囊的粒徑并沒有顯著影響（表2）。所以，海藻酸鈉溶液pH選取為5.5。

表2 海藻酸鈉溶液pH對B.bifidum F-35存活率（SGJ，2h）和微膠囊粒徑的影響Table 2 The effect of pH of alginate solution on the survival of B.bifidum F-35 in SGJ for 2h and particle size of microcapsules

2.2 海藻酸鈉溶液濃度對包衣效果的影響

隨著海藻酸鈉溶液濃度的提高，包埋的B.bifidum F-35的存活率隨之上升，并在0.3%～0.5%之間上升的幅度最高，因為海藻酸鈉溶液的粘度是隨著濃度的提高而提高，而粘度的提高有利于海藻酸鈉包覆于乳清蛋白微膠囊表面，從而抵御胃蛋白酶對乳清蛋白的降解作用并提高微膠囊對B.bifidum F-35保護效果，但濃度超過0.5%后，海藻酸鈉包衣會導(dǎo)致微膠囊的平均粒徑急劇增加，特別是濃度在0.7%和0.9%時，微膠囊的平均粒徑（303μm和386μm）要遠高于0.3%和0.5%時的平均粒徑（表3）。考慮到微膠囊最終會添加到食品中，為了不影響食品的感官特性，需要盡量控制微膠囊的粒徑，因此，海藻酸鈉溶液濃度選取為0.5%。

表3 海藻酸鈉溶液濃度對B.bifidum F-35存活率（SGJ，2h）和微膠囊粒徑的影響Table 3 The effect of concentration of alginate solution on the survival of B.bifidum F-35 in SGJ for 2h and particle size of microcapsules

2.3 攪拌速度對包衣效果的影響

由表4可知，攪拌速度對B.bifidum F-35的存活率影響不大，2h后B.bifidum F-35的存活率均處于同一顯著水平上；但它和微膠囊粒徑卻呈一定的相關(guān)性，微膠囊粒徑隨著攪拌速度的增加而降低，當攪拌速度超過500r/min時，微膠囊的粒徑變化并不顯著，說明此時的攪拌速度就足以使得乳清蛋白微膠囊完全分散于海藻酸鈉溶液中，故攪拌速度選取為500r/min。

表4 攪拌速度對B.bifidum F-35存活率（SGJ，2h）和微膠囊粒徑的影響Table 4 The effect of concentration of alginate solution on the survival of B.bifidum F-35 in SGJ for 2h and particle size of microcapsules

2.4 CaCl2濃度對包衣效果的影響

利用Ca2+可以和海藻酸鈉形成凝膠從而達到包埋雙歧桿菌的目的。當CaCl2濃度為0.01mol/L時，微膠囊對B.bifidum F-35的保護效果最差，這是因為分散在油相的CaCl2濃度越小，就越不利于Ca2+和海藻酸鈉接觸從而影響包衣效果，相反增加CaCl2濃度能夠顯著提高B.bifidum F-35在模擬胃液中的存活率，但當CaCl2濃度超過0.05mol/L后，提高的幅度并不明顯。然而考慮到高濃度的CaCl2溶液具有較高的滲透壓，而高滲透壓對益生菌又有致死作用[10-11]，并且CaCl2濃度對微膠囊的粒徑并沒有顯著影響，因此CaCl2的濃度為0.05mol/L。

表5 CaCl2濃度對B.bifidum F-35存活率（SGJ，2h）和微膠囊粒徑的影響Table 5 The effect of concentration of CaCl2on the survival of B.bifidum F-35 in SGJ for 2h and particle size of microcapsules

2.5 海藻酸鈉包衣對乳清蛋白微膠囊形態(tài)的影響

經(jīng)過海藻酸鈉包衣的微膠囊表面有一層分布均勻的薄膜，而未經(jīng)包衣的微膠囊表面并沒有類似的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，該包衣方法具有一定的可靠性。但是，包衣后微膠囊的呈球性卻不如未經(jīng)包衣的微膠囊（圖2）。這可能是因為攪拌過程中的高剪切力使得微膠囊的球型結(jié)構(gòu)被破壞。

2.6 海藻酸鈉包衣對B.bifidum F-35存活率的影響

圖2 微膠囊的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果（100×）Fig.2 Optical microscopy photographs showing the structure of microcapsules（100×）

通過上述結(jié)果得到了海藻酸鈉包衣的最佳工藝為：海藻酸鈉溶液pH5.5，海藻酸鈉溶液濃度0.5%，攪拌速度500r/min，CaCl2濃度0.05mol/L。在此工藝條件下我們制備得到經(jīng)海藻酸鈉包衣的微膠囊，該微膠囊的粒徑為133μm，包埋于其中的B.bifidum F-35在2h模擬胃液處理后的存活率為14.5%，存活量下降了不到一個對數(shù)值，而在未經(jīng)包衣的蛋白質(zhì)微膠囊中，B.bifidum F-35存活量下降了超過4個對數(shù)值，從而證實得到海藻酸鈉的二次包衣能有效提高B.bifidum F-35在模擬胃液中的存活率。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化得到了海藻酸鈉對乳清蛋白微膠囊的最佳包衣工藝條件：海藻酸鈉溶液pH為5.5，海藻酸鈉溶液濃度為0.5%，攪拌速度為500r/min，CaCl2濃度為0.05mol/L。由該工藝制備而來的微膠囊平均粒徑為133μm，此時B.bifidum F-35在2h模擬胃液中的存活率提高至14.5%。

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