過氧乙酸氧化大豆蛋白工藝參數(shù)優(yōu)化

王 朗，李軍生，閻柳娟，黃國霞

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

大豆蛋白營養(yǎng)豐富，氨基酸種類齊全，常被作為食品中蛋白質(zhì)的補(bǔ)充物，因此在食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。另外有報(bào)道稱大豆蛋白可以作為一種新型原料應(yīng)用于化工行業(yè)[1]。但是，在日常生活中，由于天然大豆蛋白基本沒有表面活性，很難滿足人們對(duì)不同蛋白質(zhì)加工性質(zhì)的需求。因此，通過改性進(jìn)而拓寬大豆蛋白的應(yīng)用范圍是人們迫切的愿望。大豆蛋白主要由β-大豆伴球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成，兩者都是大豆主要的儲(chǔ)存蛋白[2]。7S球蛋白和11S球蛋白都含有較多的二硫鍵，二硫鍵對(duì)于穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)具有重要作用[3-4]。蛋白質(zhì)在二硫鍵與其他一些化學(xué)鍵的作用下，分子內(nèi)部容易形成緊密折疊的空間結(jié)構(gòu)。因此，通過改變分子內(nèi)部的價(jià)鍵結(jié)構(gòu)從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，是一種很好的方法。如酸性水解蛋白質(zhì)，使之多肽鏈展開，進(jìn)而改變其表面活性；氧化還原內(nèi)部二硫鍵，使被埋藏的基團(tuán)暴露，進(jìn)而改變其表面活性。如李軍生等[5]利用氧化劑打開二硫鍵制得了很好的表面活性劑；袁道強(qiáng)等[6]對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行超聲處理提高了其溶解性；Karina等[7]通過對(duì)大豆蛋白進(jìn)行水解發(fā)現(xiàn)，2%的水解度可提高大豆蛋白的表面活性。乙酸是國標(biāo)規(guī)定的食品添加劑，作為酸度調(diào)節(jié)劑有著廣泛的用途，本實(shí)驗(yàn)希望利用過氧乙酸打開二硫鍵，使過氧乙酸轉(zhuǎn)化為乙酸，從而制備無毒的蛋白質(zhì)表面活性劑，并比較二硫鍵斷裂前后大豆蛋白功能特性的變化，為進(jìn)一步改性大豆蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PHS-25CVV型精密pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；LD4-2型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；VFD-2000冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；UV-2012PC型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Mikro-200臺(tái)式離心機(jī) 球興科儀國際貿(mào)易有限公司；VEGA3 EasyProbe掃描電子顯微鏡 捷克TESCAN公司；100LX型高剪切混合乳化頭 上海威宇機(jī)電制造有限公司；DT-102型全自動(dòng)界面張力儀 淄博華坤電子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氧化大豆蛋白的制備 稱取一定量大豆蛋白粉，按蛋白粉與水1∶10比例將其配制成乳液，置于三口燒瓶中，25℃下攪拌1h后離心，離心速度為4000r/min，15min后提取上清液。取一定量的上清液進(jìn)行氧化處理，處理完的溶液用酸堿調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)（pH=4.5），在4000r/min離心15min，水洗沉淀多次后，冷凍干燥，得到氧化大豆蛋白。反應(yīng)原理圖見圖1。

圖1 反應(yīng)原理圖Fig.1 Reaction schematic

1.2.2 可溶性大豆蛋白巰基及二硫鍵含量的測(cè)定 采用Ellman[8]方法并做適宜的調(diào)整，即用Ellman試劑對(duì)游離巰基進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后在波長412nm處測(cè)定吸光度A412，按下式計(jì)算游離巰基和總巰基[9]。

SH（μmol/g）=（73.53×A412×D）/C

式中：A412表示蛋白質(zhì)的吸光度；D為稀釋倍數(shù)，對(duì)于游離SH，D=15.1，對(duì)于總SH，D=76.25；C為蛋白固形物含量（mg/mL）。

測(cè)定二硫鍵含量的原理是先用巰基乙醇還原二硫鍵為SH，測(cè)定總SH含量，然后換算出二硫鍵（SS）的含量。公式如下：SS（μmol/g）=（總SH-游離SH）/2

馬錢子堿及其納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較研究 …………………………………………… 管慶霞等（20）：2777

二硫鍵打開率（%）=（大豆蛋白二硫鍵含量-氧化大豆蛋白二硫鍵含量）/大豆蛋白二硫鍵含量

1.2.3 大豆蛋白氧化工藝參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究氧化劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)二硫鍵含量的影響。每次處理重復(fù)三次，每次做三個(gè)平行。

1.2.3.1 20%過氧乙酸用量對(duì)二硫鍵含量的影響 取50mL大豆蛋白上清液，置于錐形瓶中，20%過氧乙酸加入量分別加入4%、8%、12%、16%、20%，搖勻；-10℃靜置3h，測(cè)定二硫鍵含量。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)二硫鍵含量的影響 取50mL大豆蛋白上清液，置于錐形瓶中，氧化劑用量16%，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)溫度-20、-10、0、10、20℃，測(cè)定二硫鍵含量。

1.2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)二硫鍵含量的影響 取50mL大豆蛋白上清液，置于錐形瓶中，過氧乙酸用量16%，反應(yīng)溫度-10℃，反應(yīng)時(shí)間1、2、3、4、5h，測(cè)定二硫鍵含量。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 過氧乙酸用量對(duì)巰基、游離巰基含量的影響Table 2 Effect of amount of CH3COOOH on the content of sulfhydryls and free sulfhydryls

根據(jù)以上因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)，見表1。

1.2.4 乳化性的測(cè)定 參照Pearce[10]法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 起泡性的測(cè)定 參照李維瑤等的方法[11]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 HLB值的測(cè)定 采用乳化法[12]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 CMC值的測(cè)定 采用張佳程等[13]的表面張力法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 表面張力的測(cè)定 采用表面張力儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 過氧乙酸對(duì)巰基、游離巰基含量的影響

過氧乙酸對(duì)巰基、游離巰基含量的影響如表2所示。反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度-10℃，反應(yīng)時(shí)間4h。

由表2可知，樣品蛋白的二硫鍵含量為8.11μmol/g，游離巰基和總巰基的含量都隨著氧化劑用量的增大而減小，其中，游離巰基的變化較為明顯，當(dāng)氧化劑用量為2.50mL的時(shí)候，游離巰基被全部氧化，總巰基的含量則一直呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。

2.2 過氧乙酸用量對(duì)二硫鍵含量的影響

過氧乙酸用量是影響二硫鍵含量的重要因素，過氧乙酸是打開二硫鍵反應(yīng)物之一，化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論表明：增加反應(yīng)物有助于反應(yīng)向正方向移動(dòng)。為研究氧化物用量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 過氧乙酸用量對(duì)二硫鍵含量的影響Fig.2 Effect of amount of CH3COOOH on the content of the disulfide bond

由圖2可知，隨著過氧乙酸用量的增加，大豆蛋白的二硫鍵含量呈減小趨勢(shì)。這是由于大豆蛋白中的游離SH被氧化為磺酸基，隨著過氧乙酸用量的增加，過氧乙酸除了氧化游離SH成為磺酸基還會(huì)進(jìn)一步氧化二硫鍵成為磺酸基。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)過氧乙酸用量大于20%時(shí)，經(jīng)氧化改性的大豆蛋白在等電點(diǎn)處離心無法得到沉淀，而是呈現(xiàn)出懸浮狀，這可能是由于過度氧化使得大豆蛋白嚴(yán)重變性。因此過氧乙酸用量選16%。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)二硫鍵含量的影響

反應(yīng)溫度對(duì)二硫鍵含量的影響如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)二硫鍵含量的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the content of the disulfide bond

從圖3可以看出，二硫鍵含量隨著反應(yīng)溫度增加而增加，二硫鍵含量在-10～10℃變化明顯，這可能是由于蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變與溫度的變化有關(guān)或者與反應(yīng)為放熱有關(guān)。從實(shí)際生產(chǎn)情況考慮，溫度不宜低于0℃，因此選取反應(yīng)溫度0℃。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)二硫鍵含量的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)二硫鍵含量的影響如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)二硫鍵含量的影響Fig.4 Effect of reaction time on the content of the disulfide bond

由圖4可以看出，二硫鍵的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而降低。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間4h時(shí)，大豆蛋白二硫鍵含量基本不變。因此，適宜的反應(yīng)時(shí)間4h。

2.5 大豆蛋白氧化正交實(shí)驗(yàn)

為了確定二硫鍵打開的最佳條件，在單因素的基礎(chǔ)上，選取對(duì)反應(yīng)影響最為顯著的因素：氧化劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間制定L9（34）正交表進(jìn)行正交分析。大豆蛋白氧化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

由表3極差值R可以看出，各因素對(duì)大豆蛋白二硫鍵含量的影響程度主次順序依次為：過氧乙酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，最佳反應(yīng)條件為A3B1C3，即氧化劑20%，反應(yīng)溫度-10℃，反應(yīng)時(shí)間4h，在此條件下二硫鍵含量2.91μmol/g，其打開率68.53%。方差分析結(jié)果表明，過氧乙酸用量和溫度對(duì)二硫鍵含量的影響極顯著（p＜0.01），反應(yīng)時(shí)間影響顯著（p＜0.05）。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 The orthogonal experimental design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of Variance

2.6 氧化大豆蛋白表面活性

氧化大豆蛋白表面活性如表5所示。

由表5可以看出，改性后的大豆蛋白表面活性得到了提高，其中起泡性提高了60.57%，乳化性提高了11.45%，HLB值、起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性均有所提高，表面張力、CMC值減小。

2.7 氧化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響

大豆蛋白、氧化大豆蛋白的掃描電鏡照片如圖5所示。

大豆蛋白經(jīng)過氧化處理后，進(jìn)行SEM掃描。結(jié)果顯示：未改性的大豆蛋白呈球狀。這是因?yàn)榇蠖沟鞍椎闹饕煞譃榇蠖骨虻鞍缀挺?大豆伴球蛋白。改性后的大豆蛋白結(jié)構(gòu)不同于未改性大豆蛋白，其內(nèi)部出現(xiàn)較大的縫隙，這些縫隙可能是由于二硫鍵斷裂后，蛋白質(zhì)內(nèi)部分子間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)不再受二硫鍵的限制，出現(xiàn)偏離而產(chǎn)生的結(jié)果?？p隙的出現(xiàn)使水分子較容易的通過，進(jìn)而有助于氧化大豆蛋白的提取。

表5 氧化大豆蛋白表面活性Table 5 Surface activity of oxidized soy protein

圖5 大豆蛋白、氧化大豆蛋白的掃描電鏡照片（5000×）Fig.5 The SEM picture of soy protein and oxidized soy protein（5000×）

3 結(jié)論

采用過氧乙酸氧化大豆蛋白制備表面活性劑，較其他化學(xué)方法具有無毒、易降解等特點(diǎn)，產(chǎn)品可直接應(yīng)用于食品領(lǐng)域。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了二硫鍵氧化工藝的最佳條件：20%的過氧乙酸用量20%，反應(yīng)溫度-10℃，反應(yīng)時(shí)間4h，在此條件下，二硫鍵的打開率為68.53%。

掃描電鏡顯示，氧化改性后的大豆蛋白內(nèi)部出現(xiàn)更多的縫隙，說明大豆蛋白在氧化過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

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