中國(guó)野生葡萄資源抗白腐病鑒定及抗性種質(zhì)篩選

張穎 孫海生等

摘 要： 【目的】葡萄白腐病是引起葡萄減產(chǎn)的重要病害，葡萄白腐病不但在我國(guó)流行嚴(yán)重，在世界上主要葡萄產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，由于白腐病菌難以防治，挖掘抗病種質(zhì)有利于抗病機(jī)制研究及抗病育種的開展?！痉椒ā垦芯坷檬覂?nèi)離體菌絲接種的方法，對(duì)收集到的中國(guó)野生葡萄種質(zhì)17個(gè)種、亞種及種間雜種的35個(gè)株系進(jìn)行葡萄抗白腐病鑒定。【結(jié)果】結(jié)果表明，中國(guó)野生葡萄不同種之間對(duì)白腐病的抗性存在差異，其中都安毛葡萄、塘尾葡萄實(shí)生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞鋼廟街桑葉、蘡薁武漢A1、靈寶變?nèi)~、燕山葡萄0947為抗病株系，刺葡萄♂為最抗病的株系，是研究抗白腐病機(jī)理的理想材料?！窘Y(jié)論】在中國(guó)野生葡萄中存在葡萄白腐病的抗性植株。

關(guān)鍵詞：中國(guó)野生葡萄； 抗病； 葡萄白腐病； 離體接種

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪02-0191-06

葡萄是我國(guó)栽培最廣泛的水果之一，2010年，我國(guó)葡萄栽培面積為55.2萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)843萬t，為世界第2位和第1位（來源于FAO，2010年），并且還在逐年增加，與葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展伴隨的是葡萄病害的發(fā)生和危害，白腐病是嚴(yán)重危害葡萄生產(chǎn)的四大病害之一，對(duì)葡萄的危害包括降低樹勢(shì)、損毀枝蔓、降低產(chǎn)量甚至引起絕收，嚴(yán)重威脅葡萄生產(chǎn)，如何提高葡萄對(duì)白腐病的抗性是亟待解決的問題。葡萄白腐病又稱腐爛病，致病菌為Coniothyrium diplodiella（Speq.）Sacc，屬于殼小圓孢屬，為葡萄專性寄生，不僅危害果粒還危害枝條和葉片，是葡萄生長(zhǎng)期引起果實(shí)腐爛、導(dǎo)致減產(chǎn)的主要病害。

我國(guó)葡萄的主要栽培品種是歐亞種，但是歐亞種對(duì)白腐病都缺乏抗性，起源于中國(guó)葡萄屬植物種類多、遺傳資源豐富，已知的葡萄野生種約38個(gè)種，種類約占世界的60%，并且新種還時(shí)有發(fā)現(xiàn)[1]，在這些野生種中蘊(yùn)含大量的抗性資源[2]，在前人的研究中刺葡萄、山葡萄和華東葡萄中都有抗病的株系[3]，但是受資源收集數(shù)量的限制，缺乏對(duì)中國(guó)野生葡萄資源的全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。挖掘真正的抗病種質(zhì)，研究中國(guó)野生資源的抗性機(jī)理對(duì)改良現(xiàn)有栽培品種的抗性、培育抗性新種質(zhì)有重要的實(shí)踐和理論意義?？共⌒匀斯そ臃N鑒定法可以避免田間環(huán)境條件和病原種類、數(shù)量的差異。因此，在相同條件下，采用統(tǒng)一的評(píng)價(jià)方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)大量種質(zhì)資進(jìn)行抗病性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)具有十分迫切的需求。由于利用病菌孢子接種及室外接種的鑒定方法極易受到外界環(huán)境的影響，如濕度、溫度的變化會(huì)影響病原孢子的萌發(fā)率，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得可靠的結(jié)果需要幾年的連續(xù)調(diào)查。本研究借鑒前人的鑒定方法[4]，研究者采用室內(nèi)離體鑒定的方法，避免外界條件的影響；同時(shí)采用菌絲體接種，避免因孢子萌發(fā)不整齊的誤差，制造傷口打破葉片結(jié)構(gòu)性引起的抗性反應(yīng)，以期快速準(zhǔn)確鑒定中國(guó)葡萄野生種質(zhì)中的抗病株系，并為其抗病機(jī)理的研究提供材料及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料均采自鄭州果樹研究所國(guó)家種質(zhì)（葡萄）資源圃，編號(hào)為資源圃編號(hào)

1.2 病菌培養(yǎng)

葡萄白腐病病原菌來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。葡萄白腐病病菌為葡萄專性寄生，可以離體培養(yǎng)，將病菌接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下黑暗培養(yǎng)，3 d后菌絲均勻分布，但未產(chǎn)生孢子，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 接種及保濕方法

取枝條上中部成熟葉片（葉齡10～15 d），每個(gè)處理取6枚葉片，將菌餅和無菌PDA塊（CK）分別接種葉片的正面，刺傷時(shí)避開葉片主脈，每個(gè)葉片接種1～4處，分布于葉片的不同位置，同時(shí)設(shè)6個(gè)重復(fù)，將接種后的葉片放入大培養(yǎng)皿的下底內(nèi)，上蓋覆浸濕但不滴水的濾紙，不能接觸葉片，封口膜密封保濕，28 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.4 傷口處理方法

以‘康可和‘紅地球?yàn)樵嚥?，采用無傷、接種1針刺傷、5針刺傷（均勻分布在菌餅下直徑2 mm的圓形區(qū)域內(nèi)，下同）等3種傷口處理方式，試驗(yàn)重復(fù)3次，連續(xù)觀察。

1.5 葉片正反面接種處理

以‘康可和‘紅地球?yàn)樵嚥?，分別設(shè)正、反面接種處理，利用1.2和1.3中的方法進(jìn)行處理。

1.6 處理時(shí)間

以‘康可和‘紅地球?yàn)樵嚥?，接種后利用1.2和1.3中的方法進(jìn)行處理，并在接種60 h后統(tǒng)計(jì)。該試驗(yàn)重復(fù)2次，連續(xù)2 a統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.7 種質(zhì)鑒定

綜合分析1.2、1.3、1.4處理的結(jié)果，選擇最佳處理?xiàng)l件，對(duì)已經(jīng)收集到的中國(guó)野生葡萄資源的不同種及株系，進(jìn)行白腐病抗性鑒定及抗性種質(zhì)篩選。以美洲種的‘康可和歐亞種的‘紅地球?yàn)閰⒄铡?/p>

1.8 結(jié)果統(tǒng)計(jì)及分析方法

采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑，處理間的差異顯著性分析用Duncans Multiple Range Test進(jìn)行，以常見的‘紅地球和‘康可為分級(jí)參照，抗性分級(jí)如下：Ⅰ>‘康可；‘康可<Ⅱ>‘紅地球；Ⅲ<‘紅地球，篩選抗性種質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄種質(zhì)資源鑒定刺傷條件

為了確定葉片發(fā)病程度與傷口之間關(guān)系，以‘康可和‘紅地球?yàn)樵嚥模捎梦瘁槾獭?針刺和5針刺3種處理方式，48、60、72、84 h連續(xù)統(tǒng)計(jì)病斑大小，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑，處理間的差異顯著性分析用Duncans Multiple Range Test進(jìn)行。結(jié)果顯示，在以‘康可為試材的試驗(yàn)中，病斑大小在有傷口與沒有傷口的處理中差異顯著，但是在傷口大小的處理中差異不顯著；在以‘紅地球?yàn)樵嚥牡脑囼?yàn)中，病斑大小在傷口有無與傷口大小差異均不顯著?；谝陨辖Y(jié)果以下試驗(yàn)均采用1針刺的處理方法。

2.2 葡萄種質(zhì)資源鑒定的接種位置

以‘康可和‘紅地球?yàn)樵嚥?，采?針刺的處理方法，分別在葉片正面和背面接種，接種60 h后，統(tǒng)計(jì)病斑，分析差異。結(jié)果表明，‘康可和‘紅地球葉片正面和背面接種后，病斑大小差異不顯著基于操作方便的考慮，在鑒定種質(zhì)抗性的試驗(yàn)中采用葉片正面接菌。

2.3 葡萄種質(zhì)資源鑒定

在室內(nèi)環(huán)境條件一致的情況下，以美洲種的‘康可和歐亞種的‘紅地球?yàn)閷?duì)照種質(zhì)，對(duì)中國(guó)野生種的17個(gè)種的35個(gè)株系進(jìn)行了白腐病的抗性鑒定，結(jié)果顯示其抗病性由大到小分別為：刺葡萄♂、舞鋼廟街葡萄桑葉、燕山葡萄、刺葡萄♀、武漢A1、塘尾實(shí)生、都安毛葡萄、靈寶變?nèi)~、‘康可、菱葉葡萄0945、華東1057、紅巖華東01、青要山秋葡萄、美麗葡萄1104、湖南云南葡萄、寶天曼網(wǎng)脈葡萄、葛蕌♀、葛蕌♂、湖南刺葡萄、嵩山樺葉、云南葡萄、樺葉、廣西毛葡萄、四道嶺變?nèi)~、靈寶秋葡萄、雙溪腺枝01、雙溪腺枝03、‘紅地球、桑葉943、高山2號(hào)、華佳八號(hào)、多裂葉蘡薁、桑葉1099、桑葉946、華東1058、九里溝桑葉、青要山蘡薁（圖5）。

為了使鑒定結(jié)果有一個(gè)比較直觀的表現(xiàn)，以‘康可和‘紅地球參照種質(zhì)進(jìn)行抗性分級(jí)，共分為三級(jí)，Ⅰ級(jí)抗性高于‘康可，Ⅱ級(jí)抗性處于‘康可和‘紅地球之間，Ⅲ級(jí)抗性低于‘紅地球。Ⅰ級(jí)抗性有：都安毛葡萄、塘尾葡萄實(shí)生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞鋼廟街桑葉、蘡薁武漢A1、靈寶變?nèi)~、燕山葡萄0947；Ⅱ級(jí)抗性的有：菱葉葡萄0945、華東1057、紅巖華東01、青要山秋葡萄、美麗葡萄1104、湖南云南葡萄、寶天曼網(wǎng)脈葡萄、葛蕌♀、葛蕌♂、湖南刺葡萄、嵩山樺葉、云南葡萄、樺葉、廣西毛葡萄、四道嶺變?nèi)~、靈寶秋葡萄、雙溪腺枝01、雙溪腺枝03；Ⅲ級(jí)抗性的有：桑葉943、高山2號(hào)、華佳八號(hào)、多裂葉蘡薁、桑葉1099、桑葉946、華東1058、九里溝桑葉、青要山蘡薁（表2）。結(jié)果表明，中國(guó)野生葡萄不同種之間對(duì)白腐病的抗性存在差異，刺葡萄最為抗病，腺枝葡萄最不抗??；毛葡萄、桑葉葡萄、蘡薁葡萄、變?nèi)~葡萄中存在抗病株系，其中刺葡萄♂最為抗病。

3 討 論

在田間自然條件下，來源于歐亞種的葡萄種質(zhì)都不同程度地感染白腐病，而中國(guó)野生種質(zhì)未見感病[5-7]，本試驗(yàn)中人工針刺接種時(shí)，野生種質(zhì)會(huì)有不同程度的感病，有的野生種甚至超過了歐亞種，如多裂葉蘡薁、桑葉1099、桑葉葡萄946、華東葡萄1058、九里溝桑葉、青要山蘡薁等。分析存在差異主要有兩方面的因素，其一，本試驗(yàn)中采用的是菌絲接種的方法，菌絲可以直接侵染，排除了葡萄白腐病病菌孢子不萌發(fā)造成的誤差；其二本試驗(yàn)中接菌時(shí)制造了傷口，破壞了葉片的表面結(jié)構(gòu)，排除了葡萄葉片因表面結(jié)構(gòu)造成的抗性，因此抗性反應(yīng)來源于植物內(nèi)在機(jī)制的作用，是植物本身通過內(nèi)在免疫反應(yīng)的表現(xiàn)。

王躍進(jìn)等[5]研究結(jié)果表明刺葡萄的果實(shí)表皮細(xì)胞層和角質(zhì)層比歐洲葡萄品種佳利釀厚的多，而且表皮細(xì)胞排列也緊密，有利于保護(hù)野生種葡萄免受白腐病病菌侵染。姜建福等[8]對(duì)中國(guó)野生葡萄葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，中國(guó)野生葡萄中毛葡萄、桑葉葡萄的葉片總厚度和葉片各組織厚度較小，樺葉葡萄在東亞種群中葉片總厚度和葉片各組織厚度最大，本研究中的抗性結(jié)果與其并無一定的相關(guān)性，并且從葉片結(jié)構(gòu)的角度難以解釋種內(nèi)不同株系的抗性差異。以菌絲為病原菌的侵染方式不同于自然界中病原菌的侵染方式，但是更能表現(xiàn)不同種質(zhì)內(nèi)在的免疫反應(yīng)。

在生理生化水平上，中國(guó)野生抗性種質(zhì)中的確存在內(nèi)在的抗性機(jī)理，王躍進(jìn)等[5]在研究中認(rèn)為生物體內(nèi)生化物質(zhì)對(duì)病原菌有能動(dòng)反應(yīng)，他推測(cè)是植物體內(nèi)的丹寧，游離有機(jī)酸和多酚氧化酶的高含量或高活性對(duì)病菌的擴(kuò)展起到了抑制作用。賀普超等[2]研究葡萄葉片和果實(shí)對(duì)白腐病的抗性與可溶性糖、游離有機(jī)酸和過氧化物酶活性有密切關(guān)系。

分子生物學(xué)研究表明，植物在受到病原菌入侵時(shí)，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組會(huì)發(fā)生很大的變化，轉(zhuǎn)錄因子被激活，進(jìn)而調(diào)控下游抗性基因的表達(dá)，從而達(dá)到抗病目的。重要的轉(zhuǎn)錄因子包括WRKY、MYB、ERF、NAC 等轉(zhuǎn)錄因子家族。作為葡萄白腐病抗性極強(qiáng)的種質(zhì)，進(jìn)一步從生理生化和分子生物學(xué)水平研究刺葡萄♂的抗性機(jī)理將為葡萄的抗性育種提供理論及實(shí)踐方面的依據(jù)。

4 結(jié) 論

中國(guó)野生葡萄不同種之間對(duì)白腐病的抗性存在差異，其中都安毛葡萄、塘尾葡萄實(shí)生、刺葡萄♂、刺葡萄♀、舞鋼廟街桑葉、蘡薁武漢A1、靈寶變?nèi)~、燕山葡萄0947為抗病株系，刺葡萄♂為最抗病的株系，是研究抗白腐病機(jī)理的理想材料。

參考文獻(xiàn) References：

[1] KONG Qing-shan. Chinese Ampelography[M]. Beijing：China Agricultural Science and Technology Press， 2004： 16-25.

孔慶山. 中國(guó)葡萄志[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社， 2004： 16-25.

[2] HE Pu-chao， WANG Yue-jin， WANG Guo-ying，REN Zhi-bang，HE Chun-cheng. Research Chinese wild vitis disease resistance[J]. Scientia Agricultura Sinica， 1991，24（3）： 50-56.

賀普超，王躍進(jìn)，王國(guó)英，任治邦，和純成. 中國(guó)葡萄屬野生種抗病性的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1991， 24（3）： 50-56.

[3] WANG Yue-jin， HE Pu-chao. Identification method of resistance of vitis evaluated to grape anthracnose and grape white rot[J]. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry， 1988， 16（8）： 17-21.

王躍進(jìn)，賀普超. 葡萄白腐病和黑痘病抗性鑒定方法[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1988，16（8）： 17-21.

[4] WEI Jie-ling， HUANG Li-li， HAO Zuo-peng， KE Xi-wang， KANG Zhen-sheng. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperm a sensu Kobayashi[J]. Acta Phytopa Thologicas in Ica ， 2010，40（1）： 14-20.

韋潔玲，黃麗麗，郜佐鵬，柯希望，康振生. 蘋果樹腐爛病室內(nèi)快速評(píng)價(jià)方法的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2010，40（1）： 14-20.

[5] WANG Yue-jin， HE Pu-chao. Study of white rot disease resistant mechanism in Chinese Vitis wild species[J]. Northern Horticulture， 1988（1）： 1-5.

王躍進(jìn)，賀普超. 中國(guó)葡萄屬野生種抗白腐病機(jī)制研究[J]. 北方園藝， 1988（1）： 1-5.

[6] LI Dan， WAN Yi-zhen， WANG Yue-jin， HE Pu-chao. Relatedness of resistance to anthracnose and to white rot in Chinese wild grapes[J]. Vitis， 2008，47（4）： 213-215.

[7] LI Feng， FAN Xiu-cai， LIU Chong-huai， ZHANG Ying， JIANG Jian-fu， LI Min. Investigation resistance to white rot in grape germplasm resources[J]. China Fruits，2012（3）： 72-74.

李峰，樊秀彩，劉崇懷，張穎，姜建福，李民. 葡萄種質(zhì)資源對(duì)葡萄白腐病抗性調(diào)查[J]. 中國(guó)果樹， 2012（3）： 72-74.

[8] JIANG Jian-fu， ZHANG Ying， TIAN Zhi-shuo， FAN Xiu-cai， LIU Chong-huai. Observation on microstructure and ultrastructure of leaves in Vitis L.[J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 2012，32（7）： 1365 -1371.

姜建福，張穎，田智碩，樊秀彩，劉崇懷. 葡萄屬植物葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2012， 32（7）： 1365-1371.