花生HIR基因的克隆表達與進化分析

劉羽　傳志　長生　翠　興軍

摘要：過敏性反應是植物抗病機制中最常見的形式之一。過敏性誘導反應（Hypersensitive-induced reaction）基因HIR是與過敏反應相關的一類基因，屬于PID家族成員，參與許多細胞生理過程，并與細胞程序化死亡有密切關系。本研究從花生轉錄組文庫中篩選到編碼HIR基因的部分序列，通過5′-RACE獲得花生HIR基因的全長cDNA序列，并克隆了其基因組序列。分析表明，花生HIR基因與其他物種HIR基因具有高度同源性。對6個物種共17條HIR序列使用最大似然法進行進化分析表明，該基因在進化中受到了強烈的純化選擇作用。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因的表達量在冷處理4 h時顯著降低，隨著處理時間延長其表達量逐漸回升；在病菌處理的材料中該基因的表達下調。這些結果為進一步研究HIR基因在花生抗病、耐逆中的功能奠定了基礎。

關鍵詞：花生；HIR；基因表達；抗逆；抗病；純化選擇

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0001-06

病菌侵染植物后會誘導相關基因的表達，引起物質積累和代謝途徑的改變，進而使植物表現(xiàn)出一系列的生理反應。植物依賴兩個免疫機制來對抗病原：病原物相關分子模式觸發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity， PTI）和效應子觸發(fā)的免疫（Effector-triggered immunity， ETI）[1]。在PTI途徑中，植物基于病原體分子的進化保守性來提供基本的免疫力；在ETI途徑中，植物通過識別病原體的非毒性Avr基因產(chǎn)物，激活抗性基因，產(chǎn)生過敏反應（HR），在細胞內激活一系列反應，包括活性氧的產(chǎn)生、胞內離子流的變化、細胞膜功能紊亂等[2，3]。HR反應導致感染部位細胞迅速死亡從而阻止病原體的蔓延，HR蛋白通過誘導HR反應，在植物抗病性上起著重要作用[4]。

過敏性誘導反應基因（HIR）是與HR反應相關的一類基因，他們屬于PID（Proliferation， ion channel regulation， and death）家族成員，PID蛋白由防衛(wèi)反應基因抑制素Prohibitins和Stomatins兩類蛋白組成。PID家族蛋白參與許多細胞生理過程，包括離子通道調節(jié)、細胞死亡等[5～8]。1998年，Karrer等[9]在煙草中最早鑒定出HIR基因，并證明該基因能夠在葉片中誘導PR2的表達，產(chǎn)生組織壞死，該基因被命名為NG1。隨后，Nadimpalli等[5]根據(jù)NG1氨基酸序列，在玉米中鑒定出Zm-HIR1、Zm-HIR2和Zm-HIR3三個基因。2003年，Rostoks等[10]在大麥中克隆到了Hv-HIR1、Hv-HIR2、Hv-HIR3和Hv-HIR4四個基因，其中Zm-HIR3和Hv-HIR3基因在模擬病原侵害自發(fā)壞死的突變體上出現(xiàn)了明顯的上調表達，證明HIR不僅在雙子葉植物中通過參與HR反應誘導細胞死亡及抗病功能，在多種單子葉植物中同樣參與HR反應。Jung等[11，13]將辣椒的CaHIR1和水稻的OsHIR1在擬南芥中過表達，引起了類似HR反應的組織壞死，提高了對細菌及真菌的抗性，且證明CaHIR1在胡椒抵御滲透脅迫中也發(fā)揮了重要作用。Choi等[12]發(fā)現(xiàn)CaHIR1在植物抗病及免疫過程中是參與植物細胞死亡的正調節(jié)蛋白。HIR基因已從許多植物中克隆到，花生是我國重要的經(jīng)濟作物，目前，在花生上尚未見HIR基因克隆的報道。

1材料與方法

1.1材料與處理

本研究選用花生品種魯花14號，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時間16 h，溫度28℃；黑暗8 h，溫度26℃。青枯病菌在含有紅四氮唑（TTC）的NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無菌水懸浮菌液至OD600=0.6。使用Tseng等[14]的方法侵染兩周齡花生的根，以水處理為對照。侵染48 h后將根切下，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆?。選用兩周齡花生苗進行4℃低溫處理（處理6、12、24、48 h），對照材料在25℃條件下培養(yǎng)，每日光照16 h，處理24 h后將葉片切下，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1花生總RNA提取和cDNA合成總RNA提取使用改良的CTAB法。用Eppendorf Biophotometer Plus型核酸蛋白檢測儀檢測RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。cDNA的合成參考TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明進行。

1.2.2AhHIR全長cDNA克隆從本實驗室花生果針轉錄組數(shù)據(jù)中獲得一段長為656 bp的EST序列，BLAST分析表明，該序列與大豆HIR（JN083835.1）具有高度同源性，其開放閱讀框不完整，5′端缺失約450 bp。根據(jù)該序列設計5′-RACE引物TSP1和TSP2（表1），通過Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA擴增試劑盒進行5′-RACE擴增，PCR程序為：第一輪：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)；72℃ 5 min。以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR 擴增，PCR程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min。分析測序結果后設計引物HIROF和HIROR（表1），以花生cDNA為模板克隆AhHIR的完整ORF序列。

1.2.3AhHIR基因組序列的克隆和測序分析取干凈新鮮花生種子約500 mg， 采用CTAB法提取并純化基因組DNA。利用引物HIROF和HIROR，擴增AhHIR的基因組序列，測序后與cDNA序列比對，驗證其是否為AhHIR的基因組序列。

1.2.4AhHIR的qRT-PCR分析qRT-PCR 反應以花生根和葉不同脅迫處理的cDNA作模板，以花生Actin基因為內參，以HIRQF和HIRQR為引物（表1），采用FastStart SYBR Green試劑盒（Roche）進行擴增。反應程序為：預變性95℃ 10 min；兩步法擴增95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；測定溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 15 s， 95℃ 15 s。每個反應均設3 次重復。根據(jù)溶解曲線檢測PCR產(chǎn)物的特異性。基因表達水平測定使用相對表達，通過2-△△CT方法計算。

1.2.5AhHIR的生物信息學分析AhHIR基因編碼蛋白預測使用EMBOSS Transeq（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/），跨膜區(qū)預測使用TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。使用NCBI在線工具BLAST和Phytozome下載與AhHIR同源的16條核酸和蛋白序列，用ClustalW軟件對其進行多序列比對，使用Mrbayes軟件進行進化樹構建，用Evoview繪制進化樹，使用PAML軟件包進行適應性進化分析，用Swiss-Model預測AhHIR蛋白三級結構模型，使用PFAM數(shù)據(jù)庫檢驗預測模型，使用Swiss-PDBviewer標記氨基酸位點。

1.2.6AhHIR的進化分析對與花生AhHIR同源的16條核酸序列，用ClustalW軟件進行核酸堿基序列對位排列，并對部分序列進行手動修正。使用MrBayes3.1.2軟件經(jīng)貝葉斯模型進行系統(tǒng)進化分析[21]，模型中參數(shù)使用默認值，共運行1 000 000代，每1 000代取樣一棵樹，去除前10 000代老化樣本，剩余樣本構建最終進化樹。使用上述貝葉斯樹文件和序列重排文件作為輸入樣本，每條序列存在304個氨基酸位點，使用PAML軟件包內的模型：M0、M1a、M2a、M3、M7和M8進行進化分析[22]。

2結果與分析

2.1AhHIR基因的克隆

RACE擴增結果見圖1A，經(jīng)測序、序列拼接后設計引物，擴增AhHIR的完整ORF及基因組序列，分別獲得了900 bp和1 900 bp的PCR產(chǎn)物（圖1B和圖1C），經(jīng)測序證明所克隆的序列均為花生HIR。該基因由5個外顯子和4個內含子組成（圖2）。

2.2AhHIR的表達分析

qRT-PCR結果（圖3）表明，4℃處理6 h后，葉片中AhHIR表達出現(xiàn)明顯的下調，表達水平只有對照的20%，但隨著處理時間的延長，AhHIR表達量逐漸升高，冷處理12 h后表達水平恢復到對照的47%，處理48 h后恢復到對照的76%。青枯病菌侵染48 h后根中AhHIR表達量下調約30%。

2.3AhHIR蛋白序列分析

用EMBOSS Transeq對AhHIR基因編碼的蛋白序列預測表明，該基因編碼288個氨基酸。將預測的花生HIR蛋白序列與其他5個物種的16條HIR蛋白序列使用ClustalW進行同源比對，發(fā)現(xiàn)不同物種間HIR同源性很高，達95%以上，其中花生與大豆和菜豆親緣關系最近。根據(jù)TMHMM預測結果，花生HIR蛋白存在跨膜區(qū)的概率小于0.1%，存在膜上的概率小于5%，推測該蛋白應存在于胞質中。該蛋白與其他同源蛋白相似，N端有一個十四?；母拾彼?，可將蛋白錨定到質膜上[10]。

2.4AhHIR的系統(tǒng)進化分析

選用包括花生在內的6個物種共17條HIR基因序列，根據(jù)貝葉斯模型構建進化樹（圖4），結果顯示整個進化樹的枝長較短，這與HIR基因的高度保守有關。根據(jù)進化樹各枝遺傳距離，將其分為三種類型（在進化樹中分別以色塊和括號標記），AhHIR與大豆HIR1、玉米HIR1、小麥HIR1和HIR2、大麥HIR1聚為類型A；大豆HIR4、玉米HIR4等屬于類型C，類型C的HIR基因與其他類型遺傳距離較遠。查詢PFAM蛋白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)類型C的HIR蛋白除了在N端存在與其他類型相同的Band-7結構域，還在C端存在其他結構域。

2.5選擇壓力和氨基酸替代情況分析

選用6個物種共17條HIR基因序列通過比對重排，每一條序列含有912個堿基位點，304個氨基酸位點，用PAML分析時選用的模型參數(shù)參見表2，似然率檢驗結果參見表2。根據(jù)M0模型，所有位點與分支的平均ω=0.05997，說明HIR基因在進化中受強烈的純化選擇。在M8模

大豆（G. max），NM_001289276.1；GmaHIR3：大豆（G. max），JN083834.1；GmaHIR3like： 大豆（G. max），NM_001252931.2；GmaHIR4： 大豆（G. max），JN083833.1；GmaHIR4like：大豆（G. max），NM_001254549.1；CanHIR：辣椒（Capsicum annuum）AY529867.1。

圖4不同物種HIR基因系統(tǒng)進化樹及對應的蛋白結構型BEB分析結果中，針對所有氨基酸位點的ω值進行統(tǒng)計，在99%后驗概率下，ω值≤0.1的為負選擇位點，共存在202個，占總序列的69%；ω≤0.01的負選擇位點有129個，占總數(shù)的44%。位點編號以HvuHIR1為標準（圖5）。蛋白晶體模型預測結果表明，AhHIR與同樣存在Band-7 domain的Stomatin蛋白三級結構（圖6A）相同[20]。將以上位點數(shù)據(jù)通過SwissPDB-viewer導入AhHIR晶體模型中，結果顯示這些受強烈純化選擇的氨基酸位點大多位于α螺旋和β折疊中（圖6B、C），這部分氨基酸在維持蛋白結構中非常重要，而通道區(qū)域（圖6B白色箭頭標記）的保守性相對較低。

3討論

HIR基因參與ETI途徑的免疫應答[5，10～12，18]，在植物HR反應中行使重要的功能。本研究首次在花生中克隆了HIR基因，對花生HIR氨基酸序列分析表明其存在Band-7蛋白結構域，AhHIR蛋白可能與其他家族成員一樣參與了細胞膜離子通道的控制[5]。通過qRT-PCR分析了該基因在受到生物脅迫和非生物脅迫時的表達情況，結果表明，兩種逆境脅迫均使AhHIR表達短期下調。由于HIR的表達升高可能會導致更多的細胞死亡[11]，短期內的低溫脅迫使HIR基因強烈下調有助于細胞死亡率降低，隨著低溫脅迫延續(xù)，HIR基因緩慢上調，這可使細胞死亡正?；浔磉_量并沒有超出正常表達水平。HIR基因在逆境下的表達變化可能與細胞為適應環(huán)境改變而做出的一系列生理反應有關，如誘使內源激素合成信號的傳導以及活性氧的積累[19]。

生物在進化中對環(huán)境的改變會做出一系列的適應性進化，例如核酸的突變和蛋白的變化，HIR基因在進化分析中表現(xiàn)為強烈的保守性，在99%后概率檢驗下，ω≤0.1的負選擇位點有202個，占總數(shù)的69%，ω≤0.01的負選擇位點有129個，占總數(shù)的44%，這說明HIR基因受到了強烈的純化選擇，可能是由于該基因的功能非常重要，該基因突變后植物難以存活。將這些高度保守位點導入Band-7 domain蛋白質三級結構模型發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)受強烈純化選擇的位點都位于α螺旋和β折疊中，而在3個Band-7亞基形成的通道結構中的氨基酸位點保守性相對較低。

參考文獻：

[1]Jones J D G， Dangl J L. The plant immune system [J]. Nature， 2006， 444（7117）： 323-329.

[2]Morel J B， Dangl J L. The hypersensitive response and the induction of cell death in plants [J]. Cell Death & Differentiation， 1997， 4（8）：671-683.

[3]Hofius D， Tsitsigiannis D I， Jones J D G， et al. Inducible cell death in plant immunity [J].Seminars in cancer biology， 2007， 17（2）： 166-187.

[4]Heath M C. Hypersensitive response-related death [M]//Programmed Cell Death in Higher Plants. Springer Netherlands， 2000：77-90.

[5]Nadimpalli R， Yalpani N， Johal G S， et al. Prohibitins， stomatins， and plant disease response genes compose a protein superfamily that controls cell proliferation， ion channel regulation， and death [J]. Journal of Biological Chemistry， 2000， 275（38）： 29579-29586.；

[6]Huber T B， Benzing T. The slit diaphragm： a signaling platform to regulate podocyte function [J]. Current Opinion in Nephrology and Hypertension， 2005， 14（3）： 211-216.

[7]Mishra S， Murphy L C， Nyomba B L， et al. Prohibitin： a potential target for new therapeutics [J]. Trends in Molecular Medicine， 2005， 11（4）： 192-197.

[8]Morrow I C， Parton R G. Flotillins and the PHB domain protein family： rafts， worms and anaesthetics [J]. Traffic， 2005， 6（9）： 725-740.

[9]Karrer E E， Beachy R N， Holt C A. Cloning of tobacco genes that elicit the hypersensitive response[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 36（5）： 681-690.

[10]Rostoks N， Schmierer D， Kudrna D， et al. Barley putative hypersensitive induced reaction genes： genetic mapping， sequence analyses and differential expression in disease lesion mimic mutants [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003， 107（6）： 1094-1101.

[11]Jung H W， Hwang B K. The leucine-rich repeat （LRR） protein， CaLRR1， interacts with the hypersensitive induced reaction （HIR） protein， CaHIR1， and suppresses cell death induced by the CaHIR1 protein[J]. Molecular Plant Pathology， 2007， 8（4）： 503-514.

[12]Choi H W， Kim Y J， Hwang B K. The hypersensitive induced reaction and leucine-rich repeat proteins regulate plant cell death associated with disease and plant immunity [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2011， 24（1）： 68-78.

[13]Jung H W， Lim C W， Lee S C， et al. Distinct roles of the pepper hypersensitive induced reaction protein gene CaHIR1 in disease and osmotic stress， as determined by comparative transcriptome and proteome analyses[J]. Planta， 2008， 227（2）： 409-425.

[14]Tseng H， Katawczik M， Mila A. Comparison of Ralstonia solanacearum strains isolated from tobacco and vegetable crops in North Carolina[C]. The American Phytopathological Society， 2012， 102（7）： 122.

[15]Tavernarakis N， Driscoll M， Kyrpides N C. The SPFH domain： implicated in regulating targeted protein turnover in stomatins and other membrane-associated proteins [J]. Trends in Biochemical Sciences， 1999， 24（11）： 425-427.

[16]Browman D T， Hoegg M B， Robbins S M. The SPFH domain-containing proteins： more than lipid raft markers [J]. Trends in Cell Biology， 2007， 17（8）： 394-402.

[17]Qi Y， Tsuda K， Nguyen L V， et al. Physical association of Arabidopsis hypersensitive induced reaction proteins （HIRs） with the immune receptor RPS2 [J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（36）： 31297-31307.

[18]Zhou L， Cheung M Y， Li M W， et al. Rice hypersensitive induced reaction protein 1 （OsHIR1） associates with plasma membrane and triggers hypersensitive cell death[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 290.

[19]Fujita M， Fujita Y， Noutoshi Y， et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses： a current view from the points of convergence in the stress signaling networks [J]. Current Opinion in Plant Biology， 2006， 9（4）： 436-442.

[20]Yokoyama H， Fujii S， Matsui I. Crystal structure of a core domain of stomatin from Pyrococcus horikoshii ill ustrates a novel trimeric and coiled-coil fold [J]. Journal of Molecular Biology， 2008， 376（3）： 868-878.

[21]Yang Z. PAML： a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood [J]. Computer Applications in the Biosciences： CABIOS， 1997， 13（5）： 555-556.

[22]Yang Z. Maximum likelihood estimation on large phylogenies and analysis of adaptive evolution in human influenza virus A [J]. Journal of Molecular Evolution， 2000， 51（5）： 423-432.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學2014，46（5）：7～11，30Shandong Agricultural Sciences

[12]Choi H W， Kim Y J， Hwang B K. The hypersensitive induced reaction and leucine-rich repeat proteins regulate plant cell death associated with disease and plant immunity [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2011， 24（1）： 68-78.

[13]Jung H W， Lim C W， Lee S C， et al. Distinct roles of the pepper hypersensitive induced reaction protein gene CaHIR1 in disease and osmotic stress， as determined by comparative transcriptome and proteome analyses[J]. Planta， 2008， 227（2）： 409-425.

[14]Tseng H， Katawczik M， Mila A. Comparison of Ralstonia solanacearum strains isolated from tobacco and vegetable crops in North Carolina[C]. The American Phytopathological Society， 2012， 102（7）： 122.

[15]Tavernarakis N， Driscoll M， Kyrpides N C. The SPFH domain： implicated in regulating targeted protein turnover in stomatins and other membrane-associated proteins [J]. Trends in Biochemical Sciences， 1999， 24（11）： 425-427.

[16]Browman D T， Hoegg M B， Robbins S M. The SPFH domain-containing proteins： more than lipid raft markers [J]. Trends in Cell Biology， 2007， 17（8）： 394-402.

[17]Qi Y， Tsuda K， Nguyen L V， et al. Physical association of Arabidopsis hypersensitive induced reaction proteins （HIRs） with the immune receptor RPS2 [J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（36）： 31297-31307.

[18]Zhou L， Cheung M Y， Li M W， et al. Rice hypersensitive induced reaction protein 1 （OsHIR1） associates with plasma membrane and triggers hypersensitive cell death[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 290.

[19]Fujita M， Fujita Y， Noutoshi Y， et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses： a current view from the points of convergence in the stress signaling networks [J]. Current Opinion in Plant Biology， 2006， 9（4）： 436-442.

[20]Yokoyama H， Fujii S， Matsui I. Crystal structure of a core domain of stomatin from Pyrococcus horikoshii ill ustrates a novel trimeric and coiled-coil fold [J]. Journal of Molecular Biology， 2008， 376（3）： 868-878.

[21]Yang Z. PAML： a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood [J]. Computer Applications in the Biosciences： CABIOS， 1997， 13（5）： 555-556.

[22]Yang Z. Maximum likelihood estimation on large phylogenies and analysis of adaptive evolution in human influenza virus A [J]. Journal of Molecular Evolution， 2000， 51（5）： 423-432.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學2014，46（5）：7～11，30Shandong Agricultural Sciences

[12]Choi H W， Kim Y J， Hwang B K. The hypersensitive induced reaction and leucine-rich repeat proteins regulate plant cell death associated with disease and plant immunity [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2011， 24（1）： 68-78.

[13]Jung H W， Lim C W， Lee S C， et al. Distinct roles of the pepper hypersensitive induced reaction protein gene CaHIR1 in disease and osmotic stress， as determined by comparative transcriptome and proteome analyses[J]. Planta， 2008， 227（2）： 409-425.

[14]Tseng H， Katawczik M， Mila A. Comparison of Ralstonia solanacearum strains isolated from tobacco and vegetable crops in North Carolina[C]. The American Phytopathological Society， 2012， 102（7）： 122.

[15]Tavernarakis N， Driscoll M， Kyrpides N C. The SPFH domain： implicated in regulating targeted protein turnover in stomatins and other membrane-associated proteins [J]. Trends in Biochemical Sciences， 1999， 24（11）： 425-427.

[16]Browman D T， Hoegg M B， Robbins S M. The SPFH domain-containing proteins： more than lipid raft markers [J]. Trends in Cell Biology， 2007， 17（8）： 394-402.

[17]Qi Y， Tsuda K， Nguyen L V， et al. Physical association of Arabidopsis hypersensitive induced reaction proteins （HIRs） with the immune receptor RPS2 [J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（36）： 31297-31307.

[18]Zhou L， Cheung M Y， Li M W， et al. Rice hypersensitive induced reaction protein 1 （OsHIR1） associates with plasma membrane and triggers hypersensitive cell death[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 290.

[19]Fujita M， Fujita Y， Noutoshi Y， et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses： a current view from the points of convergence in the stress signaling networks [J]. Current Opinion in Plant Biology， 2006， 9（4）： 436-442.

[20]Yokoyama H， Fujii S， Matsui I. Crystal structure of a core domain of stomatin from Pyrococcus horikoshii ill ustrates a novel trimeric and coiled-coil fold [J]. Journal of Molecular Biology， 2008， 376（3）： 868-878.

[21]Yang Z. PAML： a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood [J]. Computer Applications in the Biosciences： CABIOS， 1997， 13（5）： 555-556.

[22]Yang Z. Maximum likelihood estimation on large phylogenies and analysis of adaptive evolution in human influenza virus A [J]. Journal of Molecular Evolution， 2000， 51（5）： 423-432.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學2014，46（5）：7～11，30Shandong Agricultural Sciences