橙色果肉甜瓜β—胡蘿卜素積累的分子機理

趙軍林　喜艷　秀峰

摘要：采用HPLC分別測定了橙色果肉甜瓜Homoka和對照白色果肉甜瓜M01-3 六個發(fā)育時期的β-胡蘿卜素及葉黃素含量，并對相關(guān)基因作了生物信息學及表達分析。結(jié)果表明：隨果實發(fā)育，橙色甜瓜β-胡蘿卜素含量顯著升高，在接近成熟時達到積累高峰，成熟時又有所降低；兩種甜瓜果實中β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因PSY2、PDS、ZDS、LCY-b的表達量均升高，但橙色甜瓜中PDS和LCY-b表達量高于白色甜瓜；β-胡蘿卜素的裂解酶基因CCD1在橙色甜瓜中表達下調(diào)，而在白色甜瓜中上調(diào)。與白色果肉甜瓜M01-3相比，PDS、LCY-b的高表達和CCD1表達的下調(diào)可能決定了橙色甜瓜果實中β-胡蘿卜素的高積累量。

關(guān)鍵詞：甜瓜；果實；β-胡蘿卜素；積累

中圖分類號：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0007-06

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界重要的園藝作物，其果實營養(yǎng)豐富、芳香味濃郁、口感良好，深受消費者歡迎。甜瓜果肉色澤是甜瓜品質(zhì)的重要方面，因類胡蘿卜素和葉綠素積累量及組分的不同而不同，主要有白色、橙色和綠色等[1]，其中成熟的橙色果肉甜瓜果實中積累大量β-胡蘿卜素（β-Carotenoid）[2]。

β-胡蘿卜素是植物類胡蘿卜素代謝的一個重要產(chǎn)物，攝入人體后被轉(zhuǎn)化為維生素A，從而起到防癌、抗氧化及保護視力的作用[3～6]。β-胡蘿卜素由番茄紅素經(jīng)番茄紅素β環(huán)化酶（Lycopene β-cyclase，LCY-b）催化生成，而ε環(huán)化酶（Lycopene ε-cyclase，LCY-e）可催化番茄紅素生成δ-胡蘿卜素（δ-Carotenoid），最終生成葉黃素（Lutein）[7，8]。在植物中，這些種類繁多的色素既能使植物花和果實展現(xiàn)鮮艷的顏色，又能被裂解成多種脫輔基類胡蘿卜素參與特殊香味的形成，進一步代謝，還能生成植物激素，如脫落酸和獨角金內(nèi)酯等，參與植物生長調(diào)控[9～13]。對柑橘和甜橙果實類胡蘿卜素積累的研究表明，隨果實發(fā)育，多個參與類胡蘿卜素合成的基因共同作用，致使一種或多種類胡蘿卜素大量積累而形成特定的果色[14]。雖然甜瓜果色種類較多，但對其色素積累機理的研究較少，本試驗基于甜瓜基因組序列，選取白色果肉甜瓜為對照，對橙色果肉甜瓜β-胡蘿卜素積累的分子機制進行了研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試材料為本實驗室選育的橙色果肉厚皮甜瓜Homoka和白色果肉自交系M01-3。于2013年2月25日播種育苗，4月1日定植于山東農(nóng)業(yè)大學園藝實驗站日光溫室內(nèi)，花期人工授粉，嚴格控制自交，常規(guī)栽培管理。

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒等購自大連寶生物公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成；葉黃素和β-胡蘿卜購自Sigma公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2基因搜索及生物信息學分析

從甜瓜基因組網(wǎng)站https：//melonomics.net/genome/[15]查詢類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的序列，利用DNAMAN、Bioedit、MEGA4、Tmpred、SPOMA等分子生物學軟件作相關(guān)基因的生物信息學分析，用Primer 6.0軟件設(shè)計各基因擴增引物。

1.3半定量及實時熒光定量PCR

采用Trizol法分別提取兩種甜瓜授粉后果實6個發(fā)育時期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行半定量及實時熒光定量PCR擴增。內(nèi)參基因參照Hao等[16]選擇Actin基因（登錄號：FJ763186），引物序列見表1。

半定量PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，28個循環(huán)后拍照對比。實時熒光定量PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)，參照Livak等[17]方法計算目的基因的相對表達量。

1.4甜瓜果實β-胡蘿卜素及葉黃素含量測定

采用高效液相色譜技術(shù)測定不同時期果實中葉黃素和β-胡蘿卜素含量，參數(shù)設(shè)置為波長：450 nm；靈敏度：0.8 AUFS；流速：1 mL/min；進樣時間：45 min。

2結(jié)果與分析

2.1甜瓜果實β-胡蘿卜素及葉黃素含量

圖1結(jié)果顯示，兩種果色甜瓜果肉中葉黃素和β-胡蘿卜素含量差異明顯。白色果肉品系M01-3隨果實發(fā)育，兩種色素含量下降，成熟時含量最低。橙色果肉品種Homoka隨果實發(fā)育，β-胡蘿卜素呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，授粉45 d含量最高，成熟時有所減少；葉黃素含量基本平穩(wěn)。

2.2類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的生物信息學分析

為進一步分析甜瓜果實β-胡蘿卜素生物合成的分子機制，在甜瓜基因組測序完成的基礎(chǔ)上，對類胡蘿卜素代謝相關(guān)的6個合成酶基因和3個裂解酶基因進行生物信息學分析（表2）。結(jié)果顯示，參與分析的9個基因中，ZDS的開放閱讀框（OFR）最小，為1 086 bp，CCD7的OFR最大，為1 833 bp。除LCY-b外，其余8個基因均含有內(nèi)

圖1M01-3和Homoka甜瓜果實β-胡蘿卜素及葉黃素含量

含子，內(nèi)含子數(shù)目從4～13不等?；蚪Y(jié)構(gòu)比較表明（圖2），9個基因中，PDS最長，接近10 kb，內(nèi)含子數(shù)目最多，基因結(jié)構(gòu)較復雜；而LCY-b最短，不含內(nèi)含子，編碼區(qū)較短，基因結(jié)構(gòu)較簡單。綜上所述，這9個基因中，PDS基因序列最長。

利用ExPaSy和Strawberry-ProtComp 9.0等軟件對該9個基因推導蛋白做了等電點（pI）、分子量（Mr）及亞細胞定位（Sub-cellular location）分析。結(jié)果表明，ZDS的分子量最小，CCD7的分子量最大。亞細胞定位結(jié)果顯示，只有CCD1定位在細胞質(zhì)，其他8個蛋白均定位在葉綠體中，并含有長度不等的轉(zhuǎn)運肽（表3），表明該8種蛋白質(zhì)在葉綠體中參與催化反應。葉綠體是質(zhì)體的一種，能轉(zhuǎn)化成其他有色體，生產(chǎn)和儲存色素。在植物果實及花瓣中，有色體含有豐富的類胡蘿卜素，使果實呈現(xiàn)黃色、橙色或橙紅色。

采用半定量PCR技術(shù)，對以上9個基因中參與合成代謝的6個酶基因做了半定量分析（圖3）。結(jié)果顯示，該6個基因中，PSY2、PDS、ZDS和LCY-b的表達趨勢相似，均表現(xiàn)為隨果實發(fā)育表達上調(diào)。而PSY1在果實發(fā)育初期表達量高，隨果實發(fā)育表達下調(diào)。推測在甜瓜中，兩個拷貝的PSY可能存在組織特異性表達，PSY1在綠色組織中表達，而PSY2在果實及花中表達，隨果實發(fā)育，表現(xiàn)為相反的變化趨勢。在半定量水平上沒有檢測到LCY-e的表達，可能其在果實中的表達量相對較低，或者不表達。兩種果實的差異表現(xiàn)為橙色果實PDS和LCY-b表達量明顯高于白色果實。推測，PDS和LCY-b的表達差異可能是導致β-胡蘿卜素積累差異的主要原因。

2.4類胡蘿卜素裂解相關(guān)基因的表達分析

裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases，CCD）可催化β-胡蘿卜素氧化裂解成假紫羅酮、β-紫羅酮等參與風味形成的物質(zhì)，是類胡蘿卜素分解代謝的主要途徑。為進一步分析果實類胡蘿卜素合成物質(zhì)流的去向，對3個雙加氧裂解酶基因做了定量分析。

結(jié)果（圖4）顯示，隨果實發(fā)育，白色甜瓜CCD1表達略微上調(diào)，而橙色甜瓜呈下調(diào)趨勢。CCD7與CCD8的表達變化趨勢不明顯，其中在橙色甜瓜果實發(fā)育的第5時期（授粉后45 d），CCD7的豐度相對于第1時期突升20多倍，最后降低；白色甜瓜中檢測不到CCD8的表達，而橙色甜瓜

1～6：M01-3授粉5、10、15、20、25、30 d； 7～12：Homoken授粉9、18、27、36、45、54 d

表現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在第4時期的表達最高。β-胡蘿卜素是CCD1的底物，分解后生成芳香物質(zhì)。CCD7和CCD8是參與ABA合成的關(guān)鍵基因，在果實發(fā)育后期表達上調(diào)可能與果實成熟及脫落有關(guān)。綜上所述，推測CCD1表達的差異可能是類胡蘿卜素積累差異的另一原因。

3討論

類胡蘿卜素是廣泛存在于大自然中的一類色素，在植物中參與光合作用的光能吸收和轉(zhuǎn)化反應，同時能使器官帶有鮮艷的顏色。植物通過類胡蘿卜素代謝調(diào)節(jié)其組分及含量來響應環(huán)境刺激、滿足生長需求[18～21]。類胡蘿卜素代謝的調(diào)控在植物不同組織中存在差異，在綠色組織中主要生成參與光合作用光能吸收和轉(zhuǎn)化的葉黃素、紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)等色素[22～24]，而在花和果實中則主要在細胞有色體中積累如番茄紅素、β-胡蘿卜素等特定的色素，這些色素也是植物激素ABA和獨腳金內(nèi)酯的前體物質(zhì)。

對甜橙類胡蘿卜素生物合成的研究發(fā)現(xiàn)，隨果實成熟，果實中的類胡蘿卜素組分、成分及基因表達均發(fā)生變化，且其合成物質(zhì)流偏向β環(huán)化分支。本試驗發(fā)現(xiàn)在果實中LCY-e表達量低，而LCY-b的表達量較高，這和甜橙中的結(jié)果相符。PSY被認為是類胡蘿卜素代謝途徑中最重要的基因[25]，能在轉(zhuǎn)錄水平上響應強光、干旱、鹽脅迫和高溫等脅迫及反饋調(diào)節(jié)。擬南芥中只有一個拷貝的PSY，而甜瓜中存在兩個拷貝，即PSY1和PSY2[18，26～29]，試驗發(fā)現(xiàn)PSY1在果實發(fā)育初期表達較高，隨后下調(diào)，而PSY2表達趨勢相反，可能是因為PSY的表達存在組織特異性，PSY1在綠色組織中表達，而PSY2在非綠色組織中表達，且表現(xiàn)為相反的變化趨勢。對類胡蘿卜素分解代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)，裂解酶基因CCD1在白色甜瓜中，隨果實發(fā)育表達上調(diào)，而在橙色甜瓜中，隨果實發(fā)育表達下調(diào)。

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